利用SSR 技術分析我國16 種甜玉米的遺傳特性

黃華如 梁凱光 蟻珩鑫 梁雪蓮

（仲愷農業(yè)工程學院生命科學學院，廣州 510225）

隨著人類人口的激增，對糧食的需求不斷增加，甜玉米的營養(yǎng)價值逐漸被人們接受認可，甜玉米的種植在世界范圍得到迅速發(fā)展。根據(jù)玉米的遺傳類型和胚乳特性，甜玉米可分為3 種：普通甜玉米、超甜型甜玉米（又稱水果甜玉米）和加強型甜玉米［1］。2007 年，廣東省的甜玉米面積達到13.0 萬hm2，產量170.82 萬t，云南省種植面積約為3.5 萬hm2，產量45.00 萬t；廣西種植面積3.2 萬hm2，產量39.8萬t，浙江省甜玉米發(fā)展勢頭也較好，種植面積達1.1萬hm2，產量13.6 萬t［2］。隨著甜玉米產業(yè)的不斷發(fā)展，甜玉米品種也不斷更新?lián)Q代，科研人員利用各種先進育種技術不斷研發(fā)出新品種，為甜玉米的開發(fā)利用不斷增加新的種質資源，提高甜玉米的產量及經濟價值。

隨著生物技術的發(fā)展，分子標記技術為科研人員開發(fā)利用甜玉米資源提供了強有力的技術支持。目前，主要利用RFLP、RAPD、SSR、AFLP 四種分子標記技術研究玉米的遺傳多樣性。研究表明，SSR分子標記是目前最適合于分析玉米種質遺傳多樣性及劃分雜種優(yōu)勢群的分子標記技術［3］。

簡單重復序列標記（Simple sequence repeat，SSR），又稱為微衛(wèi)星 DNA（Microsatellite DNA）。其操作簡便、穩(wěn)定可靠、重復性好，已被廣泛用于遺傳多樣性分析、構建遺傳圖譜等研究領域。李新海等［4］利用SSR 標記技術用64 對擴增帶型穩(wěn)定的引物研究了70 份我國主要玉米自交系的遺傳變異，從中檢測出等位基因數(shù)目為248 個，結合多態(tài)性信息將70 份玉米劃群，得出劃群結果與其系譜分析和育種家經驗基本相符。黃君等［5］利用SSR 標記對54 份甜玉米自交系進行了遺傳多樣性分析，從150 對引物中篩選出了56 對擴增條帶清晰、穩(wěn)定性好的引物，分析每份玉米之間的遺傳特性。本試驗利用SSR 分子標記技術和聚類分析法分析我國16 種甜玉米的遺傳特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 選用目前我國各地大量種植的代表性甜玉米品種，共16 份。具體材料見表1。

表1 甜玉米品種及來源

1.1.2 試劑 微衛(wèi)星標記引物購自上海生物工程技術服務有限公司，EDTA、DNA Taq 聚合酶和SDS 等購自北京鼎國生物技術發(fā)展中心，其余均為國產分析純。

1.1.3 設備 DYY-6C 型垂直板電泳儀（北京市六一儀器廠），小型高速冷凍離心機（德國eppendorf 公司），DG-3C 型水平電泳槽、DY6040 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，UV-254 暗箱式紫外透射儀（北京鼎國公司），DNA 凝膠分析儀（美國GDS-800UVP），PCR 擴增儀（美國PTC-200），ALC210.4 電子分析天平（廣州市正一科技有限公司），手提式不銹鋼蒸汽消毒器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 甜玉米基因組DNA 的提取 根據(jù)SDS 法進行DNA 提取，產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 引物篩選 微衛(wèi)星標記引物購自上海生物工程技術服務有限公司，從200 對引物中篩選出10 對多態(tài)性較好的引物，引物篩選步驟如下：以金帥和皖甜1 號玉米品種的基因組DNA 為模板，更換不同的特異引物，建立以下PCR 反應體系：擴增反應體系25 μL，包括金帥DNA 模板1 μL，dNTP 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，正向、反向引物各1 μL，Taq 酶0.5 μL，用ddH2O 調整終體積至25 μL。反應程序為：94℃預變性10 min；94℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72℃延伸10 min。

1.2.3 SSR 擴增產物的聚丙烯酰胺電泳檢測 將20 mL 12%濃縮膠貯藏液、重蒸水20 mL、10%過硫酸銨0.4 mL，TEMED 15 μL，混合均勻后，溶液倒入兩玻璃板之間，膠凝固后進行電泳，預電泳15-30 min，在10 μL 擴增產物中加入2.5 μL 10×loading buffer，混勻，電泳。電泳后將凝膠板放入10%的冰乙酸中，輕搖至凝膠指示劑無色，約30 min。換用蒸餾水洗2 次，每次1-2 min 后，然后放入0.1%染色液中，輕搖15-20 min。再用蒸餾水洗2 次，各1 min，立刻放入預冷的顯影液，輕搖至DNA 條帶出現(xiàn)，約5 min，將顯影好的凝膠板用蒸餾水洗2 次，水中保存，統(tǒng)計結果并照相。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 根據(jù) SSR 產物銀染結果在相同遷移率位置上（相同的分子量片段），有帶記為1，無帶記為0，缺失記為9［6］。每個多態(tài)性位點的多態(tài)性含量（PIC），按Smith 等［7］的公式計算，PIC=1-∑f2

i，其中fi 為i 位點的基因頻率，數(shù)據(jù)處理由統(tǒng)計分析軟件LittlePrograme 完成。采用 Nei 等［8］的公式計算各自交系間的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity，GS）和遺傳距離（Genetic distance，GD）：GS= 2Nij/（Ni+Nj）；GD =1-GS. 其中，Nij 為第 i 個和第 j 個材料基因型間共有的條帶數(shù)；Ni 和 Nj 分別為第 i 個和第 j 個材料各自的特有條帶數(shù)。聚類分析按UPGMA方法對各個自交系進行聚類作圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計用NTSYSpc-2.10e 軟件完成。

2 結果

2.1 玉米總DNA電泳圖譜

利用SDS 總基因提取法提取16 種甜玉米的總DNA，并在0.8%瓊脂糖電泳中檢測，得出16 種玉米DNA 條帶。部分甜玉米品種的DNA 電泳（圖1）顯示，DNA 條帶的亮度很好，但是尾部的亮點比DNA 條帶亮度亮，說明所提取的DNA 里含有雜質。由于SSR 標記具有較高的靈敏性，所檢測的DNA 需要微量即可，故將所提取的DNA 低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 部分甜玉米電泳圖

2.2 引物篩選結果

以金帥和皖甜1 號玉米品種的基因組DNA 為模板，分別用200 對引物按1.2.3 中所述方法進行PCR，產物用0.8%瓊脂糖電泳。根據(jù)瓊脂糖電泳圖所顯示出的條帶清晰度和等位基因數(shù)的多少篩選出10 對引物。圖2 是部分引物篩選結果。

圖2 引物篩選圖譜

2.3 SSR結果分析

2.3.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳結果 在銀染后拍照，得出16 種甜玉米的指紋圖譜，從圖3 可以清晰的看到帶譜，但片段數(shù)目較多，統(tǒng)計時有些困難。可能是由于退火溫度沒有調好，造成較多的帶出現(xiàn)，但條帶清晰，對結果不會造成較大影響。圖3 為16 種甜玉米在引物6-10 中擴增的指紋圖譜。

圖3 16 種甜玉米指紋圖譜

2.3.2 分子標記結果 表2 是16 種甜玉米在10 對引物下擴增得到的總片段數(shù)目。結果顯示，16 種甜玉米擴增總片段數(shù)范圍在117-174，平均為151 條，其中特大甜出現(xiàn)的片段數(shù)最少，只有117 條，農大超甜最多，達174 條。

10 對SSR 引物在16 份甜玉米品種中共檢測出254 個等位基因位點（表3），檢測出的等位基因位點變幅為5-38 個，平均每對引物檢測出25.4個，引物39 檢測出的等位基因位點數(shù)最少，不能把16 個甜玉米品種區(qū)分開。每個位點的多態(tài)性信息量（PIC）變化為0.681 7-0.968 7，平均為0.920 8；其中引物10-8 位點的PIC 最大為0.920 8，引物39 位點的PIC 最小為0.691 7。PIC 值的大小與于檢測到的等位基因數(shù)目及基因頻率有關，反映了SSR 引物是否能把某一品種與其他品種分開的能力。

表2 16 種甜玉米擴增片段總數(shù)

表3 10 對SSR 引物擴增結果

2.3.3 遺傳相似性分析 利用NTSYS2.10e 版本軟件，計算材料之間的遺傳相似系數(shù)變化范圍。經計算得出16 個玉米品種間的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.241 3-0.964 3 之間，表明品種間遺傳差異相對較大，遺傳多樣性較高。其中金銀818 和農大超甜的遺傳相似系數(shù)最大為0.964 3，品種之間的相似系數(shù)大于 0.90 的共有5 對：秦龍?zhí)稹⑾闾? 號，皖甜1 號、華寶1 號，金銀818、超甜2000 及農大超甜、超甜2000，農大超甜、金銀818，說明它們之間有很高的相似性；超甜2000 和特大甜的遺傳相似系數(shù)最小為0.241 3，說明這兩個品種的親緣關系比較遠，遺傳差異相對較大，具有較高的多樣性。表4、表5顯示，16 個甜玉米品種間的遺傳相似系數(shù)變異較大，遺傳多樣性較豐富。

表4 16 個甜玉米品種間的遺傳相似系數(shù)

表5 其中8 個甜玉米品種間的遺傳相似系數(shù)

2.3.4 SSR 聚類分析 使用軟件NTSYSpc V2.10e 對16 份玉米材料進行聚類分析，用Qualitative data 生成16 種甜玉米之間的樹行圖（圖4）。根據(jù)聚類分析樹狀圖，以相似系數(shù)0.753 為標準，可以將16 種甜玉米聚分為3 類群。第一類群包括金帥和特大甜，共2 個品種；第二類群有10 個玉米品種，在相似系數(shù)0.794 處又可以分為2 個亞類：秦龍?zhí)?、皖?號、美珍204、東方甜1 號及金黃超甜聚為一個亞類；香甜1 號、超甜2000、農大超甜、上海甜及綠色超人聚為另一個亞類，說明它們親緣關系較近，但也有一定的遺傳差異。第三類群包括華威6 號、華寶1 號、金銀818 及粒粒香甜。第一類群由2 個品種聚成，說明它們與其他材料之間遺傳距離比較遠。第二類中的超甜2000 和農大超甜之間的相似系數(shù)最接近，變異系數(shù)較小，親緣性較大。根據(jù)雜種優(yōu)勢原理，可以選用遺傳關系相對較遠的材料來雜交。16 種甜玉米分為3 大類，遺傳距離相對較遠，可以選用3 大類之間的品種進行雜交，其中第一類的金帥和特大甜與其他品種進行雜交的優(yōu)勢會更明顯。

圖4 16 種甜玉米的聚類圖

3 討論

本試驗從200 對引物中篩選出10 對SSR 引物對16 種甜玉米進行遺傳特性分析。經過PCR 擴增，共檢測到254 個等位基因，平均25.4 個，平均PIC值為0.920 8。這一結果無論是平均等位基因數(shù)還是平均PIC 值都高于李新海等［9］的甜玉米的PIC 值（0.511）。遺傳相似系數(shù)從 0.241 3 到 0.964 3，平均為0.602 8，表明16 個甜玉米品種間遺傳差異相對較大，遺傳多樣性較高。以相似系數(shù)0.753 為標準，可以將16 種甜玉米聚為3 類群。本試驗表明，SSR 分析對DNA 純度要求不高，且?guī)头€(wěn)定，多態(tài)性豐富，同時 SSR 標記有試驗操作簡單、耗時少、成本低等優(yōu)點［10］。本試驗的16 個甜玉米品種的遺傳相似系數(shù)在 0.241 3-0.964 3 之間，平均為0.602 8，說明多數(shù)材料間具有一定的遺傳差異，但總體材料遺傳基礎相對比較狹窄，這可能與選材范圍不夠廣泛及核心SSR 引物的篩選有關。試驗中總DNA 的提取、核心引物的篩選、SSR 技術操作的成熟度均會對試驗結果有一定影響，所以尋找到一種快速有效的方法是得出正確結果的重要因素［11］。利用SSR 分子標記和聚類分析手段，可以對不同物種的遺傳距離、親緣關系等進行分析。從而確定物種之間的遺傳距離，進而進行種群分類。趙瑞芳等［12］利用SSR 分子標記技術研究了12 個玉米品種間的遺傳關系，聚類分析結果表明，12 個玉米品種間的聚類劃群結果與玉米品種的系譜來源基本一致。

4 結論

在本次試驗中將供試的16 個甜玉米品種劃分為3 個類群，聚類結果與16 個甜玉米品種的種植區(qū)域基本一致。結果再次證明利用 SSR 標記進行甜玉米品種間的遺傳特性分析及種群分類是可行的。

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