耐輻射奇異球菌R12海藻糖合成酶基因的克隆與表達(dá)

吳 茜，楊 鑫，朱麗英，張婧涵，徐 嫻，江 凌，

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京210009；2.南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京210009；3.南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京210009）

耐輻射奇異球菌（Deinococcus wulumuqiensis）R12是一類極端微生物，它不僅對(duì)電離輻射、紫外輻射以及許多DNA損傷試劑具有抗性，還對(duì)干燥、過氧化物等具有較強(qiáng)的抗性。研究表明，耐輻射奇異球菌在環(huán)境脅迫下具有合成海藻糖的能力［1］。海藻糖是一種非還原性二糖，由2分子葡萄糖以1，1－糖苷鍵連接而成，其化學(xué)性質(zhì)極穩(wěn)定，無毒無害，不會(huì)焦糖化，是一種安全的天然多糖。海藻糖廣泛存在于低等植物、藻類、細(xì)菌、真菌、酵母、昆蟲及無脊椎動(dòng)物中，既是一種貯存性糖類，又是應(yīng)激代謝的重要產(chǎn)物。由于海藻糖具有保護(hù)生物細(xì)胞和生物活性物質(zhì)在脫水、干旱、高溫、冷凍、高滲透壓及有毒試劑等不良環(huán)境下活性免遭破壞的功能，已被廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、化妝品、食品加工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域［2－3］，受到研究者的廣泛關(guān)注，發(fā)展前景廣闊。

海藻糖有多種合成方法，如：天然生物提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法、基因工程法等，但都有一定弊端，而海藻糖合成酶以其一步催化的優(yōu)點(diǎn)，成為近年來研究熱點(diǎn)［4－6］。其催化過程能耗低、底物麥芽糖來源廣且價(jià)格低，使得生產(chǎn)成本大大降低；此外，海藻糖合成酶特異性較強(qiáng)，只作用于麥芽糖轉(zhuǎn)化成海藻糖，工藝簡(jiǎn)單，易于調(diào)控。因此，以麥芽糖為原料利用海藻糖合成酶生產(chǎn)海藻糖是一條極具工業(yè)化前景的途徑［7－8］。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

菌株Deinococcus wulumuqiensis R12、E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3），自行保存；質(zhì)粒PMD18Tvector、pET－22b（＋），TAKARA公司。

酵母粉、蛋白胨，英國(guó)OXOID公司；DNA marker、DNA凝膠回收試劑盒，TAKARA公司；氨芐青霉素，南京生興生物有限公司；瓊脂糖，Promega分裝；其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提?。?］

取1～4mL野生型D.wulumuqiensis R12的過夜培養(yǎng)物，于12 000r·min－1離心2min，棄上清。細(xì)菌沉淀加入150μL的TE buffer（含RNaseA1），用槍吸打至充分懸浮細(xì)菌沉淀，提取總DNA。

1.2.2 基因克隆和重組表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)GenBank公布的序列設(shè)計(jì)引物，下劃線部分分別為BamHⅠ和HindⅢ的酶切位點(diǎn)：

上游引物F：CGGGATCCGATGACGCAAGCA－CAAC

下游引物R：CAAGCTTGTTCAGCCGCAGCCAGT

PCR條件為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃30s，60℃30s，72℃1min；完成30個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片斷，與T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，菌落PCR篩選陽性克隆，送樣測(cè)序。

經(jīng)測(cè)序無誤后小量提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和HindⅢ對(duì)質(zhì)粒及表達(dá)載體pET－22b進(jìn)行雙酶切，分別回收目的片段，連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化表達(dá)E.coli BL21（DE3）。

1.2.3 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取重組菌單菌落至LB氨芐液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜后，按1%的接種量轉(zhuǎn)接至新的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.6，加IPTG至終濃度為1mmol·L－1，誘導(dǎo)4h、6h、8h，等量取樣，10 000r·min－1離心2min，收集菌體。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析［10］

取發(fā)酵液2mL，離心，收集菌體，加PBS重懸，冰浴超聲破碎（工作4s，間隔2s，總5min）后，于10 000 r·min－1、4℃離心10min，取上清，加入2倍上清體積的緩沖溶液，沸水浴5min，取23μL點(diǎn)樣，進(jìn)行SDS－PAGE分析。

1.2.5 重組酶的酶活測(cè)定

取發(fā)酵液2mL，離心，收集菌體，加PBS重懸，冰浴超聲破碎（工作4s，間隔2s，總5min）后，于10 000 r·min－1、4℃離心10min，取上清，即為粗酶液。取粗酶液100μL與等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的麥芽糖溶液混合，靜置30min，沸水浴5min終止反應(yīng)。

1.2.6 含量測(cè)定

離心收集反應(yīng)液的上清，稀釋1 000倍進(jìn)樣。使用Ultimate 3000型高效液相色譜儀進(jìn)行含量測(cè)定。色譜柱為氨基柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈－水（67∶33，體積比）；流速0.9mL·min－1；柱溫35℃；檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器；進(jìn)樣量10μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 海藻糖合成酶基因treS表達(dá)載體的構(gòu)建

圖1 D.wulumuqiensis R12中海藻糖合成酶基因treS的序列Fig.1 Gene sequence of treSin D.wulumuqiensis R12

應(yīng)用Illumina HiSeq系統(tǒng)測(cè)定了D.wulumuqiensis R12的基因組草圖［11］，在GenBank中進(jìn)行核酸序列的Blast檢索分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其核酸序列與已報(bào)道的D.wulumuqiensis R12中海藻糖合成酶基因treS的核酸序列（圖1）有95%的同源性。

以D.wulumuqiensis R12總DNA為模板，F(xiàn)、R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到分子量約1 700bp的DNA片段，與目的基因大小相符。將擴(kuò)增得到的DNA片段回收后與T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，經(jīng)測(cè)序無誤后小量提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和HindⅢ對(duì)質(zhì)粒及表達(dá)載體pET－22b進(jìn)行雙酶切，連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，菌落經(jīng)PCR驗(yàn)證為陽性克?。▓D2）。

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS－PAGE分析

圖2 重組菌菌落鑒定Fig.2 Identification of recombinant bacteria colony

重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體，用PBS緩沖溶液重懸菌體，在冰上經(jīng)超聲破碎后，離心，分離上清和沉淀。用0.4μm濾膜過濾上清后，用Ni柱和His－tag的親和性進(jìn)行分離和純化，將粗酶液和純化液進(jìn)行SDS－PAGE分析，結(jié)果見圖3。

圖3 重組表達(dá)蛋白的SDS－PAGE分析Fig.3 Analysis of recombinant expression proteins by SDS－PAGE

由圖3可看出，與圖3b中2、3泳道含空載體的表達(dá)宿主蛋白相比，圖3a中重組菌表達(dá)出大小約66 kDa的目的蛋白，經(jīng)純化后，圖3a中7、9泳道純化蛋白達(dá)到分析純，可用于后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)研究。

2.3 重組酶性質(zhì)的初步研究

以30%的麥芽糖為底物和重組酶進(jìn)行麥芽糖轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，以確定最適反應(yīng)溫度及pH值，然后利用HPLC分析反應(yīng)物中海藻糖含量（占總糖的百分比），結(jié)果如圖4、5所示。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on enzymatic activity

圖5 pH值對(duì)酶活的影響Fig.5 Effect of pH value on enzymatic activity

由圖4可看出，當(dāng)反應(yīng)溫度在25～35℃時(shí)，重組酶的活性隨反應(yīng)溫度的升高而上升，當(dāng)反應(yīng)溫度超過35℃后，重組酶的活性逐漸下降。說明重組酶在35℃時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。

由圖5可看出，當(dāng)pH值在6.5～8.0時(shí)，重組酶的活性隨pH值的增大而上升，當(dāng)pH值大于8.0后，重組酶的活性逐漸下降。說明重組酶在酸性至中性條件下轉(zhuǎn)化率較高，在pH值為8.0時(shí)轉(zhuǎn)化率最高。

以上結(jié)果表明：重組酶在35℃和pH值為8.0時(shí)活性最高，生成海藻糖最多，此時(shí)的轉(zhuǎn)化率約為67%。

3 結(jié)論

采用PCR法，以D.wulumuqiensis R12基因組DNA為模板，克隆出分子量約1 700bp的海藻糖合成酶基因treS，將其與T載體連接，并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α獲得重組子，涂布劃線后進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。然后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到約66kDa的目的蛋白。經(jīng)酶活測(cè)定，誘導(dǎo)表達(dá)的重組海藻糖合成酶能將麥芽糖一步催化成海藻糖。以30%麥芽糖為底物進(jìn)行海藻糖轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，該海藻糖合成酶在35℃、pH值為8.0時(shí)催化效率最高，轉(zhuǎn)化率達(dá)到67%。

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