耐貯型番茄子葉再生體系建立及優(yōu)化

李文楓，李景富，許向陽(yáng)，張賀

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

耐貯型番茄子葉再生體系建立及優(yōu)化

李文楓，李景富*，許向陽(yáng)，張賀

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱 150030）

以耐貯型番茄08076和09836為試驗(yàn)材料，利用葉盤(pán)法以子葉為外植體，對(duì)不同濃度激素組合和基因型影響再生體系不定芽分化和再分化因素進(jìn)行探討，優(yōu)化激素組合濃度并建立耐貯型番茄高效再生體系。結(jié)果表明，最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1，最佳再分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.75·L-1；不同基因型番茄的再生體系性狀表現(xiàn)差異，其中平均出芽數(shù)差異顯著。

耐貯型番茄；子葉；再生體系

番茄（Lycopersicuf esculentumMill）是世界上重要的蔬菜作物之一。含有rin或nor基因的番茄品系具有耐貯藏、適合運(yùn)輸和延長(zhǎng)貨架期特點(diǎn)，但這一特性常與果實(shí)品質(zhì)下降相關(guān)聯(lián)，其中最主要的番茄紅素含量降低[1-2]。

本文提出以含rin、nor基因耐貯型番茄為受體材料，通過(guò)基因工程手段，將番茄高色素hp2基因轉(zhuǎn)化到受體材料中，以有效提高番茄紅素含量，選育既耐貯藏又具有優(yōu)良商品性的番茄品種。但含rin、nor基因番茄材料為受體材料的再生體系尚未見(jiàn)報(bào)道，建立完善高效的耐貯型番茄再生體系尤為重要。

番茄屬于雙子葉植物，近年來(lái)，研究者多以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，以子葉或下胚軸為外植體[3-5]，采用生長(zhǎng)素6-BA和細(xì)胞分裂素IAA或激動(dòng)素ZT組合對(duì)番茄再生體系進(jìn)行研究[6-8]。本研究以6-BA和IAA為主要研究因子，獲得適合耐貯型番茄子葉再生體系的最佳濃度激素組合，為耐貯型番茄基因工程育種提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供試番茄材料08076和09836由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所提供。材料是該研究所通過(guò)傳統(tǒng)育種方式，利用rin、nor基因分別改善優(yōu)良品種獲得的新耐貯型番茄材料。其中番茄品系08076含有遲熟rin基因，番茄品系09836含有成熟抑制nor基因。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

MS（Murashige and Skoog）粉購(gòu)自荷蘭Duchefa公司；6-BA、IAA購(gòu)自Sigma公司；蔗糖、瓊脂為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 番茄種子表面消毒和無(wú)菌苗的培養(yǎng)

取籽粒飽滿的番茄種子，用20%NaClO消毒15 min，無(wú)菌水洗3次，在滅菌的干燥濾紙上吸干殘液，種子間隔5 mm均勻接種到無(wú)菌苗培養(yǎng)基（1/2MS基本培養(yǎng)基，pH 5.8，瓊脂0.7%）上；在28℃黑暗條件下培養(yǎng)3～5 d，以胚根露出2～3 mm時(shí)移至人工培養(yǎng)箱光下繼續(xù)培養(yǎng)，光照條件每天16 h，光照強(qiáng)度1 600～1 800 lx，培養(yǎng)溫度為（26±1）℃，至無(wú)菌苗子葉展開(kāi)真葉分化一心時(shí)，備用。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)及不定芽分化

采用葉盤(pán)法以MS為基本培養(yǎng)基（pH 5.8，瓊脂0.7%），附加不同濃度的細(xì)胞分裂素（6-BA）和生長(zhǎng)素（IAA）。將6-BA濃度（1.0 mg·L-1，1.5 mg·L-1，2.0 mg·L-1）與IAA濃度（0.2 mg·L-1，0.5 mg·L-1，0.75 mg·L-1）設(shè)置9個(gè)組合（見(jiàn)表1）。每處理組合使用20個(gè)葉塊，設(shè)置3次重復(fù)。

表1 不同濃度激素組合Table 1 Different concentrations of the hormone combination

具體操作為切除子葉葉尖和葉柄后，在最寬處縱切一刀，切成5 mm×5 mm的葉塊，間隔1 cm均勻地接種到培養(yǎng)基上，每周繼代一次；將其放到光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度（26±1）℃，光照每天16 h，光照強(qiáng)度1 600～1 800 lx；接種21 d后統(tǒng)計(jì)愈傷數(shù)，接種40 d后統(tǒng)計(jì)出芽數(shù)和出芽總數(shù)，計(jì)算愈傷率、分化率和平均出芽數(shù)。

愈傷率（%）=有愈傷組織形成的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；分化率（%）=有芽形成的外植體數(shù)/有愈傷的外植體數(shù)×100%；平均出芽數(shù)=總出芽數(shù)/有芽形成的外植體數(shù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖，DPS 7.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度激素組合對(duì)不定芽分化的影響

方差和多重比較分析表明，不同濃度的6-BA和IAA激素組合分別對(duì)番茄品系08076和09836不定芽愈傷率性狀存在極顯著差異（見(jiàn)表2，圖1）。

番茄品系08076在6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1和6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素組合水平下愈傷率較低（≤90%），其中6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素組合水平下番茄品系08076愈傷率最低為88.33%。其他激素組合水平對(duì)番茄品系08076愈傷率均較高（95%～100%），在愈傷率性狀上差異不顯著；番茄品系09836在6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5mg·L-1和6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素組合水平下愈傷率較低（≤90%），其中6-BA 1.5 mg·L-1+ IAA 0.2 mg·L-1激素組合水平下番茄品系09836愈傷率最低為88.33%。其他激素組合水平愈傷率均較高（95%～100%），除6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1外在愈傷率性狀上差異不顯著。同時(shí)表明，6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素組合水平下番茄品系08076和09836愈傷率均最高達(dá)100%。

表2 不同濃度激素組合對(duì)番茄品系08076和09836出愈率和分化率的影響Table 2 Effect of different concentration medium of 6-BA and IAA on frequency of callus and buds formation in tomato 08076 and 09836

圖1 不同濃度激素組合對(duì)番茄品系08076和09836愈傷率的影響Fig.1 Effect of different hormone combinations on calli frequency from 08076 and 09836

2.2 不同濃度激素組合對(duì)不定芽再分化的影響

通過(guò)方差和多重比較分別分析不定芽再分化的兩個(gè)指標(biāo)，不定芽分化率和平均出芽數(shù)。

不同濃度的6-BA和IAA激素組合分別對(duì)番茄品系08076和09836不定芽分化率性狀均存在顯著差異（見(jiàn)表2，圖2）。番茄品系08076在6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 0.75 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1和6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素組合水平上不定芽分化率較低（≤89.74%），其中6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素組合水平下番茄品系08076分化率最低為86.3%。其他激素組合水平分化率均較高（92.59%～98.25%），在不定芽分化率性狀上差異不顯著；番茄品系09836在6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.5 mg·L-1、6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.75 mg·L-1和6-BA 2.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1激素組合水平上不定芽分化率偏低（≤89.65%），其中6-BA 1.0 mg·L-1+ IAA 0.2 mg·L-1分化率最低為83.33%。其他激素組合水平分化率均較高（92.88%～100%），在不定芽分化率性狀上差異不顯著。同時(shí)表明，6-BA 1.5 mg·L-1+ IAA 0.75 mg·L-1激素組合水平下番茄品系08076和09836分化率最高，分別為98.25%和100%。

圖2 不同濃度激素組合分別對(duì)番茄品系08076和09836分化率的影響Fig.2 Effect of different hormone combinations on differentiation frequency from 08076 and 09836

不同濃度的6-BA和IAA激素組合對(duì)番茄品系08076和09836平均出芽數(shù)性狀均存在極顯著差異（見(jiàn)表2，圖3）。

品系08076平均出芽數(shù)大于5的激素組合處理1個(gè)，平均出芽數(shù)介于4～5的激素組合處理2個(gè)，平均出芽數(shù)介于3～4的激素組合處理3個(gè)，平均出芽數(shù)介于2～3的激素組合處理3個(gè)；品系09836平均出芽數(shù)大于6的激素組合處理1個(gè)，平均出芽數(shù)介于4～5的激素組合處理2個(gè)，平均出芽數(shù)介于3～4的激素組合處理5個(gè)，平均出芽數(shù)介于2～3的激素組合處理1個(gè)。同時(shí)表明，在對(duì)番茄品系08076和09836平均出芽數(shù)最高的3個(gè)激素組合水平中，IAA濃度均為0.75 mg·L-1，并以6-BA 1.5 mg·L-1+ IAA 0.75 mg·L-1平均出芽數(shù)最高。

圖3 不同濃度激素組合對(duì)番茄品系08076和09836平均出芽數(shù)的影響Fig.3 Effect of different hormone combinations on average number of buds from 08076 and 09836

2.3 不同基因型對(duì)番茄再生體系性狀的影響

在相同培養(yǎng)條件下，對(duì)08076和09836兩個(gè)基因型再生體系性狀愈傷率、分化率和平均出芽數(shù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行整體方差分析。由表3可知，6-BA和IAA濃度對(duì)08076和09836在愈傷率、分化率和平均出芽數(shù)性狀上F值存在差異，前兩者未達(dá)顯著水平，但平均出芽數(shù)性狀表現(xiàn)顯著性差異。進(jìn)而對(duì)平均出芽數(shù)采用新復(fù)極差法分析，表明09836平均出芽數(shù)（3.81±1.14aA）顯著高于08076平均出芽數(shù)（3.58±1.12bA）?？膳卸ɑ蛐褪菦Q定不定芽再分化階段的因素之一。

表3 不同處理間08076和09836再生體系性狀的方差分析Table 3 Analysis variance of 08076 and 09836 regeneration with different treatments

3 討論與結(jié)論

番茄不同基因型間不定芽的愈傷率和分化率有所不同[4,8-9]。本研究通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在相同培養(yǎng)條件下番茄品系08076和09836不定芽分化和再分化各性狀數(shù)值不同且獲得高頻再生體系，本試驗(yàn)中，兩品系的不定芽分化率最低值為86%，從栽培角度分析分化率較高的原因可能與其分杈能力強(qiáng)有關(guān)系，可進(jìn)一步從基因角度研究其不定芽分化率和平均出芽數(shù)較高的原因。

平均出芽數(shù)性狀作為再生體系優(yōu)化的重要指標(biāo)之一，多數(shù)研究者在考查再生體系指標(biāo)中明確了平均出芽數(shù)的重要性[9-10]，以平均出芽數(shù)多的材料為優(yōu)，但是針對(duì)不同基因型在數(shù)據(jù)處理上未進(jìn)行方差分析。利用品種間差異針對(duì)不同激素濃度組合，發(fā)現(xiàn)08076和09836處理間對(duì)平均出芽數(shù)產(chǎn)生顯著差異，說(shuō)明不同基因型番茄可能對(duì)再生體系中再分化階段具有顯著影響。針對(duì)不同基因型番茄品種的再生體系進(jìn)行研究，再分化階段應(yīng)是研究重點(diǎn)，尤其平均出芽數(shù)指標(biāo)不可或缺。利用方差分析同樣驗(yàn)證09836的再生體系性狀均高于或顯著高于08076，番茄品系09836更適于作為遺傳轉(zhuǎn)化及相關(guān)研究的材料。

優(yōu)化再生體系可構(gòu)建更適合工業(yè)生產(chǎn)的激素濃度組合。通過(guò)優(yōu)化激素濃度最終確定番茄品系08076和09836的高頻再生體系以MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1為不定芽分化培養(yǎng)基，MS+ 6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.75 mg·L-1為不定芽再分化培養(yǎng)基，為小濃度變化的激素水平組合篩選提供有力保障，達(dá)到預(yù)期試驗(yàn)結(jié)果起到優(yōu)化作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)針對(duì)番茄品系08076和09836在分化和再分化過(guò)程中可考慮使用同一激素水平（6-BA 1.5 mg·L-1+ IAA 0.75 mg·L-1），均產(chǎn)生較高的愈傷率、分化率和平均出芽數(shù)，可再進(jìn)一步細(xì)化激素濃度得到更適合工業(yè)化生產(chǎn)組培苗的再生體系培養(yǎng)基。

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Establish and optimize of plant regeneration system of long storage tomato cotyledon explants

LI Wenfeng,LI Jingfu,XU xiangyang,ZHANG He(School of Horticulture,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

In this research,we used long storage tomato genotype 08076 and 09836 as experiment materials,and leaf disc method to analyze different hormone concentrations,genotype affected to plant regeneration and redifferentiation,and optimize the combination of different hormone concentrations.The results showed that the best medium for regeneration was MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IAA 0.2 mg·L-1,and the best medium for redifferentiation was MS+6-BA 1.5 mg·L-1+IAA 0.75 mg·L-1;the average budding number performance significant different from genotype on regeneration system.

long storage tomato;cotyledons;regeneration system

X836

A

1005-9369（2014）02-0024-05

時(shí)間2014-1-17 16:41:47[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140117.1641.016.html

李文楓,李景富,許向陽(yáng),等.耐貯型番茄子葉再生體系建立及優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(2):24-28.

Li Wenfeng,Li Jingfu,Xu Xiangyang,et al.Establish and optimize of plant regeneration system of long storage tomato cotyledon explants[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(2):24-28.(in Chinese with English abstract)

2012-10-12

國(guó)家十二五科技支撐計(jì)劃（2012BAD02B02）

李文楓（1982-），女，博士，研究方向?yàn)槭卟朔N質(zhì)資源創(chuàng)新及生物工程。E-mail：lwfangel@163.com

李景富，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槭卟俗魑镞z傳育種及生物技術(shù)。E-mail：Ljf-2005@126.com