HPLC 法同時測定防己黃芪湯中5 種成分

劉書芬， 梁倩倩， 陳 巖， 李金龍， 施 杞， 王擁軍*

(1. 上海中醫(yī)藥大學脊柱病研究所，上海200032;2. 上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海200032)

防己黃芪湯出自張仲景《金匱要略》，為風濕在表，衛(wèi)虛不固而癥見脈浮身重，汗出惡風而設(shè)。全方主要由防己、黃芪、白術(shù)、甘草組成，動物實驗證明有抗炎、鎮(zhèn)痛、利尿、降血脂等作用，臨床加減可用于治療風濕性或類風濕性關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、肝硬化等［1］。

防己和黃芪共為方中君藥，防己中主要成分粉防己堿和防己諾林堿均有抗炎、鎮(zhèn)痛等作用［2］;黃芪中黃酮類成分具有改善血液循環(huán)，提高免疫力的作用，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷等為其主要有效成分。甘草為方中使藥，甘草酸是甘草中最重要的有效成分之一，具有抗炎、抗?jié)?、抗過敏等作用［3］;甘草苷對神經(jīng)有保護作用［4］。

防己黃芪顆?？捎肏PLC-DAD 檢測防己諾林堿、粉防己堿，另用HPLC-ELSD 檢測黃芪甲苷的量，均未涉及甘草中的成分測定［5］。 《中國藥典》2010 年版規(guī)定的含量測定項，防己以防己諾林堿、粉防己堿作為質(zhì)控指標，黃芪以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷作為質(zhì)控指標，甘草以甘草苷、甘草酸作為質(zhì)控指標［6］。文獻報道的有關(guān)上述5 種成分的定量測定方法有薄層掃描法［7］、紫外分光光度法［8］、高效液相色譜法［9］、非水毛細管電泳法［10］、高效毛細管電泳法［11］等。

關(guān)于防己黃芪湯中多種藥材的多種成分同時測定尚未見報道。鑒于此，本實驗建立高效液相色譜法同時測定防己黃芪湯中防己諾林堿、粉防己堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸5 種指標性成分的分析方法，為其全面客觀質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1200 高效液相色譜儀，G1315D DAD 檢測器，上海精科儀器有限公司FA1004N 電子天平。甲醇(色譜純，DIKMA 公司);純凈水(Thermo純水儀生產(chǎn));其余試劑均為分析純。毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號20120428)、甘草苷(批號20100805)、甘草酸(批號20130128)、防己諾林堿(批 號 20110729 ) 和 粉 防 己 堿 (批 號20110928)均購于上海永恒生物科技有限公司。

2 色譜條件

DIKMA Diamonsil C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為甲醇-0.2 mol/L 乙酸銨0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫;體積流量0.780 mL/min;進樣量10 μL;柱溫為30 ℃。檢測波長為254 nm 和270 nm。梯度洗脫程序見表1，各樣品色譜圖見圖1。

圖1 防己黃芪湯樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of Fangji Huangqi Decoction samples

表1 梯度洗脫順序Tab.1 Gradient elution mode

3 實驗方法與結(jié)果

3.1 樣品的制備 按照防己-黃芪-白術(shù)-甘草(4 ∶5 ∶3 ∶2)的比例稱取藥材，參照文獻［12］先以10 倍量70%乙醇回流提取2 次，每次1.5 h;再以12 倍量水煎煮2 次，每次1.5 h。最后合并所有水提取液及醇提液，濃縮成0.8 ～1.3 g 濃縮液相當于1 g 生藥材。

3.2 供試品溶液的制備 取防己黃芪湯提取液0.6 g，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加50%甲醇定容，超聲處理30 min，放冷至室溫，補加50%甲醇定容至25 mL，搖勻，高速離心，進樣。

3.3 對照品溶液的制備 分別取防己諾林堿、粉防己堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷和甘草酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含防己諾林堿50 μg、粉防己堿222 μg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷111 μg、甘草苷244 μg 和甘草酸222 μg 的混合溶液作為對照品溶液。

3.4 線性關(guān)系考察 取“3.3”項制備對照品溶液，稀釋配成不同質(zhì)量濃度的混合對照品系列溶液，進樣10 μL。以對照品峰面積為縱坐標(Y)，相應對照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得相應對照品的回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 各對照品的線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of reference substances

3.5 空白試驗 分別將原方中去除黃芪、防己、甘草藥材，按制劑工藝方法制備分別得到3 種陰性制劑。分別取0.6 g 陰性制劑，加50%甲醇25 mL，按定量測定方法分析，3 種陰性樣品色譜在毛蕊異黃酮葡萄糖苷、防己諾林堿、粉防己堿、甘草苷和甘草酸相應保留時間位置無干擾峰。

3.6 穩(wěn)定性試驗 同一樣品(批號20130125)供試液，測定0、4、8、24、60、64 h 樣品中有效成分，測定峰面積。結(jié)果表明，供試液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、防己諾林堿、粉防己堿和甘草酸在64 h 內(nèi)穩(wěn)定，其穩(wěn)定性RSD 分別為2.6%、1.3%、2.2%、2.8%、1.4%，均小于3%，表明樣品在室溫下放置64 h 穩(wěn)定。

3.7 精密度試驗 同一供試液(批號20130125)，按照上述方法測定，連續(xù)進樣6 次，測定峰面積。結(jié)果供試液中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、防己諾林堿、粉防己堿和甘草酸的RSD 分別為1.2%、1.1%、1.7%、1.2%、1.7%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

3.8 重復性試驗 同一批號(批號20130125)制劑，精密稱取6 份，每份約0.6 g，按“3.2”項下方法平行操作進行測定，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、防己諾林堿、粉防己堿和甘草酸的色譜峰面積 RSD 分別為2.8%、2.5%、2.2%、2.5%、2.6%，均小于3%，表明重復性良好。

3.9 回收率試驗 同一批號(批號20130125)制劑，精密稱取9 份，每份約0.3g，分別加入高、中、低3 個質(zhì)量濃度的對照品混合液，按“3.2”項下方法進行測定，計算回收率，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷高、中、低質(zhì)量濃度的加樣回收率分別為102.1%、 98.7%、 89.2%， RSD 為 0.7%、1.6%、2.2%;甘草苷的加樣回收率分別為100.9%、 99.3%、 96.2%， RSD 為 0.6%、1.7%、1.6%;防己諾林堿的加樣回收率分別為99.9%、94.2%、94.7%，RSD 為2.0%、2.5%、2.4%;粉防己堿的加樣回收率分別為98.3%、101.4%、 102.3%， RSD 為 1.2%、 2.8%、2.9%;甘草酸的加樣回收率分別為94.9%、93.4%、89.0%，RSD 為1.2%、0.9%、2.8%。

3.10 樣品測定 取防己黃芪湯樣品(批號分別為20130626，20130627，20130628)按上述方法測定，按外標二點法計算，結(jié)果見表3。

4 討論

4.1 本實驗測定的防己黃芪湯中的5 種成分涉及3 類成分，包括黃酮類、萜類及生物堿，各自的最大吸收在254 ～280 nm 范圍內(nèi)，經(jīng)全波長掃描并兼顧5 種成分最大吸收波長，確定檢測波長為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草酸為254 nm，防己諾林堿、粉防己堿、甘草苷為270 nm，以建立色譜條件。由于黃芪中黃芪甲苷是紫外末端吸收，最大吸收波長是203 nm 左右，干擾較大，常采用ELSD 檢測器測定，因而本實驗并未考慮采用紫外檢測器對黃芪甲苷進行測定。

表3 防己黃芪湯中5 種成分測定結(jié)果(±s)Tab.3 Measurement results of five constituents in Fangji Huangqi Decoction (±s)

表3 防己黃芪湯中5 種成分測定結(jié)果(±s)Tab.3 Measurement results of five constituents in Fangji Huangqi Decoction (±s)

批次 毛蕊異黃酮葡萄糖苷/(mg·g -1)甘草苷/(mg·g -1)防己諾林堿/(mg·g -1)粉防己堿/(mg·g -1)甘草酸/(mg·g -1)20130626 0.494 2 ±0.014 4 3.029 8 ±0.049 0 0.145 1 ±0.004 0 0.292 2 ±0.003 9 0.044 6 ±0.000 4 20130627 0.471 2 ±0.010 6 3.066 1 ±0.023 8 0.145 9 ±0.001 0 0.289 6 ±0.003 3 0.045 1 ±0.001 2 20130628 0.501 2 ±0.014 0 3.015 4 ±0.029 6 0.146 3 ±0.003 0 0.273 4 ±0.001 5 0.044 8 ±0.001 0

4.2 為保證被定量化合物良好的分離度和適當?shù)谋Ａ魰r間，參考《中國藥典》選擇酸性條件進行分離，選用1%、0.5%、0.1% 甲酸溶液為流動相，比較不同質(zhì)量分數(shù)的甲酸對被分離化合物的分離度和峰形的影響，結(jié)果0.1%甲酸溶液條件下，5 種成分峰形均較好，且與其他的相鄰峰能夠完全分離，因此選擇0.1%甲酸溶液。對流動相中添加磷酸鹽、乙酸鹽進行比較，發(fā)現(xiàn)使用乙酸銨能大大改善峰形，但其濃度對峰形影響較小。

4.3 對提取溶劑進行了系統(tǒng)考察。分別選取甲醇、50%甲醇、50%乙醇、乙醇為溶劑，對同一樣品超聲提取30 min，比較待測化合物的峰面積，發(fā)現(xiàn)采用50%甲醇做提取溶劑時，各色譜峰的峰面積總和比其他3 種溶劑均大，因此選擇50%甲醇作為提取溶劑。

4.4 由于中藥復方藥味較多，常采用對君藥或用藥量較多的藥味的主要成分建立定量測定方法進行質(zhì)量控制，此種質(zhì)控方法較為片面。本實驗同時測定了防己黃芪湯中多種藥材的多種成分，且方法穩(wěn)定、精密度高、專屬性好，具有較強實用性，為其他品種的中成藥質(zhì)量控制起到了一定的啟示作用。

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