野鴉椿籽不同極性提取物抗菌作用研究

羅李娜， 向德標(biāo)， 胡喬銘， 裴 剛

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室，湖南 長(zhǎng)沙410208)

野鴉椿Euscaphis japonica 為省沽油科Staphyleaceae 野鴉椿屬Euscaphis 落葉灌木，野鴉椿籽為其干燥果實(shí)［1］。野鴉椿籽有溫中理氣，消腫止痛，祛風(fēng)除濕之效［2］。據(jù)《湖南藥物志》載:野鴉椿籽治寒疝腫痛、睪丸腫、脫肛、子宮脫垂?！端拇ㄖ兴幹尽份d:野鴉椿籽性微溫，味苦，無(wú)毒，可治月瘕、月經(jīng)不調(diào)、膀胱疝氣、痢疾泄瀉?！陡＝ㄋ幬镏尽份d: “果治頭痛，眩暈，感冒，蕁麻疹，漆過(guò)敏，疝氣;根治風(fēng)濕，腰痛，胃痛，產(chǎn)后風(fēng)。在福建南平地區(qū)，民間常用野鴉椿籽水煎液用于產(chǎn)婦產(chǎn)褥感染所致的發(fā)燒及炎癥的治療。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球每年至少導(dǎo)致75 000 名產(chǎn)婦死亡，發(fā)展中國(guó)家由于衛(wèi)生條件和治療技術(shù)較落后，成為了產(chǎn)褥熱的高發(fā)區(qū)［3］，產(chǎn)褥感染主要致病菌為甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌、肺炎雙球菌等［4-5］。早在19 世紀(jì)晚期，Louis Pasteur 發(fā)現(xiàn)并提出產(chǎn)褥感染主要是由鏈球菌引起的［6］。趙宏偉等［7］研究表明，乙型溶血性鏈球菌是鏈球菌中致病性最強(qiáng)的一種，可引起各種化膿性炎癥、產(chǎn)褥熱。為此，本實(shí)驗(yàn)研究野鴉椿籽不同極性部位提取物對(duì)臨床分離的菌株和常見致病菌的抑制作用，通過(guò)體外活性篩選抑菌實(shí)驗(yàn)，從抑菌活性的角度出發(fā)，為尋找天然藥物中抑菌的成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材 野鴉椿籽，采于福建省南平，經(jīng)鑒定為省沽油科植物野鴉椿Euscaphis japonica 的干燥果實(shí)。

1.2 供試菌種 金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，甲型溶血性鏈球菌，乙型溶血性鏈球菌，肺炎鏈球菌，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)微生物與免疫學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)。

1.3 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂(杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20110823-02);營(yíng)養(yǎng)肉湯(杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20110926-05);血瓊脂平板(鄭州安圖綠科生物工程有限公司，批號(hào)20121211);小牛血清(杭州四季青公司，批號(hào)9610003)。

1.4 儀器設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-75KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 (GNP-9160BS-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 耐藥菌株的篩選 采用瓊脂平板法［8］，參照武雪芬［9］的方法判斷結(jié)果。

2.2 不同極性提取物的制備 分別稱取2 份干燥粉碎野鴉椿籽，每份400 g。一份置于圓底燒瓶中，加水回流提取3次，每次加水1 000 mL 回流提取2 h，合并提取液，濃縮至小體積，加入無(wú)水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置24 h，過(guò)濾沉淀，母液濃縮干燥，分別得到水提醇沉物51.3 g，水提醇沉液濃縮物23.8 g;另一份野鴉椿籽置于圓底燒瓶中，加70%乙醇回流提取3 次，每次加乙醇1 000 mL，回流提取2 h，合并提取液，回收乙醇，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，分別得二氯甲烷萃取物15.3 g，乙酸乙酯萃取物32.2 g，正丁醇萃取物18.5 g，水溶物9.3 g。臨用前將不同極性部位低溫冷凍干燥成粉末，分別取2.4 g，溶于30 mL 適當(dāng)溶劑配制成80 mg/mL 的溶液。

2.3 培養(yǎng)基的制備 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌(120 ℃，15 Pa)30 min 后，冷卻至60 ℃時(shí)倒入培養(yǎng)皿中，制備平板培養(yǎng)基，備用;營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌(120 ℃，15 Pa)30 min 后，冷卻，備用。

2.4 菌懸液的制備 將所有供試菌株分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 活化，待用。挑取瓊脂平板上形態(tài)相同的菌落，用滅菌生理鹽水校正菌液濃度，再用營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋至含菌量約107CFU/mL。稀釋后的菌液在15 min 內(nèi)接種，備用。

2.5 MIC 的測(cè)定［10］取滅菌小試管11 支為一組，其中每組第11 支為陰性對(duì)照。每支試管分別加入營(yíng)養(yǎng)肉湯2 mL。配制野鴉椿籽不同極性提取物原液質(zhì)量濃度為80 mg/mL。用吸管吸取藥液1 mL 放入第1 管內(nèi)，混勻后吸取1 mL 放入第2 管，同樣混勻后吸出1 mL 放入第3 管。依此二倍稀釋法［11］逐管進(jìn)行稀釋至第10 管。各管藥質(zhì)量物濃度分別為40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 1 mg/mL，未達(dá)到抑菌質(zhì)量濃度按原液質(zhì)量濃度一倍增加或者一倍稀釋。各管均加入菌液0.1 mL，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出，觀察生長(zhǎng)情況。在對(duì)照管符合要求的情況下，以肉眼未見生長(zhǎng)的最低藥物質(zhì)量濃度為野鴉椿籽對(duì)細(xì)菌的MIC。再?gòu)奈匆娂?xì)菌生長(zhǎng)的試管中取0.02 mL 于相應(yīng)培養(yǎng)基的瓊脂平板上作次代培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)夜，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果列于表1、表2。

由表1 可知，醇提取液抑菌效果較水提取液抑菌效果明顯，與同一批次乙醇提取液萃取得到的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取液以及萃取后水層液，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌五種致病菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果列于表2。

表1 水提物與醇提物MIC (mg/mL)*

表2 不同極性萃取液MIC (mg/mL)

結(jié)果顯示，野鴉椿籽提取物對(duì)各實(shí)驗(yàn)菌株均有不同程度的抑制作用，對(duì)甲型溶血性鏈球菌的抑制作用最強(qiáng)，二氯甲烷部分、正丁醇部分對(duì)各實(shí)驗(yàn)菌株的抑制作用最強(qiáng)，與乙醇提取液相比，二氯甲烷部分對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌抑制效果較好，正丁醇部分對(duì)乙型溶血性鏈球菌也較好，萃取后水層部分MIC 值均為10.00 mg/mL。

3 小結(jié)與討論

目前，溶血性鏈球菌為產(chǎn)褥熱最常見的致病菌，同時(shí)又表現(xiàn)為多重耐藥性，給臨床治療帶來(lái)了極大的困難。隨著抗生素的濫用，給人們帶來(lái)的危害越來(lái)越明顯了，細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性和抗藥性，以致普通的抗生素對(duì)一些炎癥起不到應(yīng)有的療效。近年來(lái)，鏈球菌感染致產(chǎn)褥熱成為了主流的研究方向，Green［12］對(duì)上世紀(jì)80 年代歐洲導(dǎo)致產(chǎn)褥熱死亡的致病菌進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)致病菌為革蘭陽(yáng)性甲型鏈球菌。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示野鴉椿籽中的有效成分對(duì)由甲型溶血性鏈球菌為主引起的炎癥能起到很好的療效。野鴨椿過(guò)去作為觀賞性植物研究較多，但是關(guān)于藥用成分及作用機(jī)理研究未引起人們的重視［13-14］。2004 年來(lái)，有關(guān)野鴉椿的研究文獻(xiàn)逐年增多，多集中于其抗炎、抗纖維化、抗細(xì)胞增殖等方面的報(bào)道。臨床上其用于殺蟲和殺菌，為研究野鴉椿的藥理指明了方向。目前，野鴉椿的殺蟲殺菌、抗炎、抗肝纖維及抗癌成分的篩選及研究正處于發(fā)展中，發(fā)展前景廣闊［15］。2012 年8 月1 日，國(guó)家出臺(tái)的《抗菌藥物臨床應(yīng)用管理辦法》正式實(shí)施，該辦法的實(shí)施使抗生素的臨床應(yīng)用受到限制，同時(shí)也為治療感染的中成藥新藥研發(fā)提供了更大的發(fā)展機(jī)會(huì)。

在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)野鴉椿籽總提取物具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用，因此擬定對(duì)其抗菌活性部位進(jìn)一步追蹤。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野鴉椿籽不同溶劑提取物對(duì)5 種供試細(xì)菌的抑制作用均較為明顯，為野鴉椿籽抑菌活性部位，所選細(xì)菌也具有一定的代表性。乙醇提取液對(duì)5 種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、甲型溶血性鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌的抑制活性均較高;二氯甲烷萃取液、正丁醇萃取液對(duì)5 種菌的MIC 也較高，對(duì)金黃色葡萄球菌效果最好的是二氯甲烷萃取液，大腸桿菌和甲型溶血性鏈球菌尤以乙醇提取液抑菌效果最好，正丁醇萃取液對(duì)乙型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌抑菌效果最好。抑菌活性部位和活性成分的確定為進(jìn)一步闡明野鴉椿籽有效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野鴉椿籽提取物對(duì)5 種菌均有很強(qiáng)的抗菌活性，尤其是二氯甲烷、正丁醇部位。目前，正針對(duì)這兩部分進(jìn)行進(jìn)一步研究其化學(xué)成分和活性，從而發(fā)現(xiàn)新的活性單體，篩選出抗菌活性更強(qiáng)的天然抑菌劑。

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