乳痛軟堅(jiān)片對(duì)大鼠乳腺組織VEGF、MVD 表達(dá)研究

劉 慧， 劉麗芳* ， 姚 菲

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007;2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530023)

乳腺增生病占女性患病率首位，非典型增生認(rèn)為是乳腺癌的臨界性病變［1］。中醫(yī)藥是目前治療乳腺增生病的最佳治療手段之一，乳痛軟堅(jiān)片是我院院內(nèi)制劑，已在臨床上使用多年有著穩(wěn)定確切的療效，本研究將對(duì)其治療乳腺增生病作用機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步探討。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康，未孕，SD 雌性大鼠60 只，(200 ±20)g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證:SCXK (湘)2009-0012)。

1.1.2 藥物 乳痛軟堅(jiān)片:柴胡、陳皮、延胡索、川楝子、白芍、當(dāng)歸、莪術(shù)、貝母、海蛤粉、黨參、甘草等，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供(0.3 g/片，湘藥制字Z20070274，批號(hào)101109);紅金消結(jié)濃縮丸:金蕎麥、五香血藤、大紅袍、柴胡、三七、香附、八角蓮、鼠婦蟲、黑螞蟻、雞矢藤等(云南楚雄云中制藥有限公司，0.2 g/丸，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20080315，批號(hào)100604)。

1.1.3 試劑 苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)1005061);黃體酮(天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)1012091);F ⅧAg 多 克 隆 抗 體 (factor v3related antigen(F8)兔抗:博士德BA0046);VEGF-R1 (兔抗，博士德BA0487);SABC 試劑盒 (小鼠/兔，博士德SA1020);DAB 顯色試劑盒(黃)X20 (博士德AR1022);3%雙氧水(博士德AR1108);PBS、枸櫞酸鈉緩沖液均由博士德提供;無水乙醇、二甲苯、蘇木素、鹽酸、多聚甲醛、生理鹽水、中性樹脂等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器 電子天平;生物組織自動(dòng)脫水機(jī);生物組織包埋中心;石蠟切片機(jī);彈片烤片機(jī);電熱恒溫水溫箱;微波爐(WP800TL23-K3);纖維攝像系統(tǒng);Motic Images Advanced3.2;圖像分析系統(tǒng);IEISS 三目生物顯微鏡;游標(biāo)卡尺;自制大鼠灌胃器等。

1.2 方法

1.2.1 乳腺增生病模型大鼠建立與評(píng)價(jià) 60 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(A 組，10 只)、模型制備組(50 只)，正常組大鼠大腿外側(cè)肌肉注射生理鹽水0.5 mg/kg，每天1 次，連續(xù)30 d;模型制備組肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5 mg/kg，每天1 次，連續(xù)25 d，隨后肌肉注射黃體酮4 mg/kg，每天1 次，連續(xù)5 d，并夾尾刺激30 min/d，建立肝郁痰凝型乳腺增生病模型。造模后，模型動(dòng)物出現(xiàn)毛色枯黃，體質(zhì)量增加慢甚至停滯等現(xiàn)象;肉眼觀察，模型動(dòng)物的乳頭高度明顯高于正常組;隨機(jī)取模型制備組10只、正常組2 只取乳腺組織做病理切片，光鏡下與正常組比較乳腺小葉數(shù)目增多，腺泡明顯擴(kuò)張等增生病理改變出現(xiàn)表明造膜成功。

1.2.2 分組與給藥 造膜成功的大鼠進(jìn)行隨機(jī)均衡分組，B 組為模型對(duì)照組，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)C、D、E 分別為乳痛軟堅(jiān)片低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組，F(xiàn) 組為紅金消結(jié)濃縮丸陽(yáng)性藥物對(duì)照組，A 組仍為正常對(duì)照組，每組均為8 只。按照陳奇［2］《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》體表面積換算，乳痛軟堅(jiān)片中劑量組換算為臨床日用量等效劑量，C、D、E 組按1 ∶2 ∶4比例用藥，分別為0.32、0.64、1.29 g/kg;F 組0.55 g/kg，藥物研末，分別稱取各劑量藥物，用蒸餾水溶解稀釋，置于4 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存待用，最終各組均以10 mL/(kg·d)的溶劑灌胃，A、B 組大鼠灌相當(dāng)量的生理鹽水，為期30 d。

1.2.3 病理取材及檢測(cè) 6 組大鼠造膜30 d、灌胃30 d 后脫頸處死，取第2 對(duì)乳腺組織，左乳腺組織經(jīng)石蠟包埋，切片(4 ～5 μm)，HE 染色;右乳經(jīng)石蠟切片用SABC 法進(jìn)行免疫組化染色:切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化酶，枸櫞酸工作液微波爐中抗原熱修復(fù)，冷卻后BSA 封閉，一抗VEGF-R1 (濃度1 ∶150，F(xiàn)ⅧAg 濃度為1 ∶100)4 ℃過夜，二抗、辣根過氧化酶依次孵育，DAB避光顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精封色，中性樹脂封片，觀察。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 大鼠行為學(xué)指標(biāo) 觀察大鼠是否存在“皮毛欠光、豎毛、脫毛、弓背、怕冷、倦怠、反應(yīng)遲鈍、易激惹、急躁”，分別按“無、輕微、明顯”各項(xiàng)均采取等級(jí)分別打0、1、2 分［3］;最終9 項(xiàng)分?jǐn)?shù)在0 ～5 之間者，終得分計(jì)為0 分，在6 ～11 之間者終得分計(jì)為1 分，在12 ～18 之間者終得分計(jì)為2 分。

1.3.2 乳房直徑及乳頭高度、直徑 于最后一次灌胃后24 h 處死大鼠后用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量大鼠第2 對(duì)左右兩乳房直徑、乳頭高度和直徑，并對(duì)其外形進(jìn)行觀察。

1.3.3 乳腺病理觀察 取HE 染色切片光鏡下觀察，利用圖像分析軟件采集圖像并測(cè)量乳腺小葉及腺泡，在200 倍下測(cè)量乳腺小葉數(shù)量;400 倍下測(cè)量乳腺小葉的腺泡數(shù)量和直徑，每張病理片觀測(cè)3 個(gè)視野取其平均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.3.4 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、微 血 管 密 度 (Micro-Vascular Density，MVD) 免疫組化染色切片用三目生物顯微鏡觀察，Motic Images Advanced 3.2 采集圖像，并進(jìn)行圖像分析。微血管密度(MVD)采取血管內(nèi)皮細(xì)胞抗原(FⅧAg)來反映，主要標(biāo)記于核周，細(xì)胞周圍也有少量標(biāo)記，MVD 計(jì)數(shù)參照Weidner 法［4］:乳腺組織內(nèi)孤立的棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞族代表1 條單獨(dú)的微血管。先在低倍鏡下(100X)瀏覽全片，找出微血管密度大的“熱點(diǎn)”(hot spot)，換高倍鏡(200X)，每張切片記錄5 個(gè)“熱點(diǎn)”，取其平均數(shù)作為該病例的MVD;VEGF 染色結(jié)果參照《實(shí)用腫瘤病理方法學(xué)》［5］:細(xì)胞漿、胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野，計(jì)每個(gè)視野200 個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，取其平均值: ＜25% (-)，25%～50% (+)，50% ～75% (+ +)，＞75% (+ + +)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)指標(biāo) 造模后模型對(duì)照組大鼠幾乎都出現(xiàn)豎毛、皮毛欠光、脫毛、弓背、倦怠、怕冷、反應(yīng)遲鈍、易激惹、急躁等表現(xiàn)(與正常對(duì)照組比較，P ＜0.01)，表明造模后大鼠出現(xiàn)性情改變，病證模型出現(xiàn);藥物干預(yù)后經(jīng)乳痛軟堅(jiān)片中、高劑量組及紅金消結(jié)濃縮丸陽(yáng)性藥物組癥狀均得到不同程度的改善(與模型對(duì)照組比較，均為P ＜0.01);且中、高劑量組、陽(yáng)性藥物組均優(yōu)于低劑量組(與低劑量組比較，均為P ＜0.01);表明藥物干預(yù)可以改善大鼠的性情，且跟劑量相關(guān)。見表1，數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析Dunnett’s T3 檢驗(yàn)。

表1 大鼠行為學(xué)指標(biāo)［終得分(±s)］

表1 大鼠行為學(xué)指標(biāo)［終得分(±s)］

注:與正常對(duì)照組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01;與模型對(duì)照組比較，☆P ＜0.05，★P ＜0.01;與低劑量組比較，○P ＜0.05，●P ＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù) 平均得分正常對(duì)照組1.13 ±0.35模型對(duì)照組 8 2.75 ±0.46▲乳痛軟堅(jiān)片低劑量組 8 2.38 ±0.52△乳痛軟堅(jiān)片中劑量組 8 1.38 ±0.52☆○乳痛軟堅(jiān)片高劑量組 8 1.38 ±0.52☆○陽(yáng)性藥物對(duì)照組 8 1.13 ±0.35 8★●

2.2 第2 對(duì)乳頭高度、直徑及乳房直徑 造模后肉眼觀察大鼠乳房明顯可見乳頭高聳、變粗，乳頭周圍毛發(fā)裸區(qū)范圍均明顯擴(kuò)大(P ＜0.01)，顏色鮮紅，經(jīng)藥物干預(yù)后乳痛軟堅(jiān)片中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組得到不同程度的改善(P ＜0.01)。詳見表2，數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析LSD。

表2 乳頭高度、乳頭直徑、乳房直徑(±s)

表2 乳頭高度、乳頭直徑、乳房直徑(±s)

注:與正常對(duì)照組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01;與模型對(duì)照組比較，☆P ＜0.05，★P ＜0.01;與低劑量組比較，○P ＜0.05，●P ＜0.01;與中劑量組比較，◇P ＜0.05，◆P ＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù) 乳頭高度/mm 乳頭直徑/mm 乳房直徑/cm正常對(duì)照組1.14 ±0.11 0.81 ±0.03 0.55 ±0.09模型對(duì)照組 8 1.94 ±0.14▲ 0.94 ±0.03▲ 1.37 ±0.10▲乳痛軟堅(jiān)片低劑量組 8 1.83 ±0.13▲ 0.93 ±0.03▲ 1.36 ±0.12▲乳痛軟堅(jiān)片中劑量組 8 1.49 ±0.12▲★● 0.92 ±0.02▲ 1.20 ±0.08▲★●乳痛軟堅(jiān)片高劑量組 8 1.38 ±0.15▲★● 0.88 ±0.02▲★●◆ 0.70 ±0.10▲★●◆陽(yáng)性藥物對(duì)照組 8 1.40 ±0.13▲★● 0.85 ±0.02▲★●◆ 0.73 ±0.10 8▲★●◆

2.3 乳腺病理切片 正常乳腺組織導(dǎo)管上皮細(xì)胞排列整齊，導(dǎo)管腔腺腔無擴(kuò)張，小葉及小葉腺胞數(shù)相對(duì)較少(圖1A)。經(jīng)造模后乳腺組織均可見到典型的增生灶，導(dǎo)管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞增生，管腔明顯擴(kuò)張，內(nèi)可見較多脫落的上皮細(xì)胞及分泌物，小葉及腺泡數(shù)明顯增加(P ＜0.01)，細(xì)胞層數(shù)增加(P ＜0.05)，間質(zhì)可見毛細(xì)血管擴(kuò)張?jiān)龆?，纖維結(jié)締組織也可見增生(圖1B)。干預(yù)后，病理增生得到不同程度改善，乳腺導(dǎo)管上皮排列基本規(guī)則，擴(kuò)張明顯減輕，小葉體積及腺泡數(shù)明顯減少(P ＜0.01)，高劑量組導(dǎo)管上皮細(xì)胞增生層數(shù)減少(P ＜0.05) (圖1C至1F)。見表3、圖1。腺泡數(shù)目比較用當(dāng)因素方差分析LSD 法，細(xì)胞增生層數(shù)用Dunnett’s T3 法。

表3 乳腺病理鏡檢(±s)

表3 乳腺病理鏡檢(±s)

注:與正常對(duì)照組比較，△P ＜0.05、▲P ＜0.01;與模型對(duì)照組比較，☆P ＜0.05，★P ＜0.01;與低劑量組比較，○P ＜0.05，●P ＜0.01;與中劑量組比較，◇P ＜0.05，◆P ＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù) 乳腺小葉平均腺泡數(shù)目/(個(gè)/視野)細(xì)胞增生層數(shù)/(層/視野)8 7.00 ±1.20 2.13 ±0.35模型對(duì)照組 8 17.50 ±0.93▲ 3.13 ±0.64△乳痛軟堅(jiān)片低劑量組 8 17.1 ±0.83▲ 2.88 ±0.64乳痛軟堅(jiān)片中劑量組 8 15.00 ±1.07▲★● 2.50 ±0.53乳痛軟堅(jiān)片高劑量組 8 13.35 ±1.04▲★●◆ 2.13 ±0.35☆陽(yáng)性藥物對(duì)照組 8 12.13 ±1.55▲★●◆正常對(duì)照組2.38 ±0.52

圖1 大鼠病理圖片(HE，×400)

2.4 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( VEGF) 、微血管密度( MVD)正常對(duì)照組MVD 數(shù)目較少，可見少量被染成棕黃色的血管及單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞(圖2A)，造模后腺泡及其周圍可見較多陽(yáng)性著色(P ＜0.01)(圖2B);經(jīng)干預(yù)后，乳痛軟堅(jiān)片高劑量組及陽(yáng)性藥物組MVD 數(shù)目有不同程度下降(P ＜0.05)(圖2E 到圖2F)。正常對(duì)照組VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目亦較少，顏色較淺(圖3A);造模后腺泡及其周圍可見較明顯陽(yáng)性著色(P ＜0.01)(圖3B);經(jīng)干預(yù)后，乳痛軟堅(jiān)片中、高劑量組及陽(yáng)性藥物組VEGF 的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度下降(P ＜0.01) (圖3D 到圖3F)。見表4、圖2、圖3。VEGF用等級(jí)資料的秩和檢驗(yàn)，MVD 用單因素方差分析LSD 法。

3 討論

血管生成與乳腺增生、非典型增生及癌前病變這一變化過程密切相關(guān)。血管形成在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)中起重要作用，并受一系列促進(jìn)和抑制因子的調(diào)節(jié)作用，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF 是其中最重要的促進(jìn)因子之一，具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的功能，特異性促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖，同時(shí)增加血管通透性，使血漿蛋白外漏，基底膜隨之降解，最終導(dǎo)致新的基質(zhì)及血管形成。乳腺癌彩色血流分級(jí)隨著VEGF 表達(dá)水平的升高而明顯增多，且乳腺癌者VEGF 蛋白在乳腺的表達(dá)與MVD 數(shù)值呈正相關(guān)［6］。乳腺非典型增生過程中已伴隨有新生血管生成，并隨非典型增生程度的加重而增多，MVD 可以反映乳腺癌前病變的惡性傾向［7］。隨著乳腺增生程度的加重及中醫(yī)證型從肝郁氣滯到痰瘀互結(jié)型的轉(zhuǎn)變，VEGF、MVD 表達(dá)呈升高趨勢(shì)［8-9］。臨床上藥物控制新生血管生成，對(duì)于逆轉(zhuǎn)乳腺癌前病變及預(yù)防乳腺癌的發(fā)生意義重大。檢測(cè)藥物對(duì)血管生成的影響能反映藥物干預(yù)乳腺增生進(jìn)程的作用及作用機(jī)制。

表4 乳腺組織VEGF、MVD 表達(dá)(±s)

表4 乳腺組織VEGF、MVD 表達(dá)(±s)

注:與正常對(duì)照組比較，△P ＜0.05、▲P ＜0.01;與模型對(duì)照組比較，☆P ＜0.05，★P ＜0.01;與低劑量組比較，○P ＜0.05，●P ＜0.01;與中劑量組比較，◇P ＜0.05，◆P ＜0.01。VEGF 總體比較，χ2 =13.92，#P=0.016，P ＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù) VEGF/例#- + + + MVD/(個(gè)/HP)8 6 2 0 11.8 ±1.3模型對(duì)照組 8 0 5 3▲ 25.9 ±1.25▲乳痛軟堅(jiān)片低劑量組 8 0 4 4▲ 24.9 ±1.6▲乳痛軟堅(jiān)片中劑量組 8 1 4 3▲ 18.3 ±2.6▲★●乳痛軟堅(jiān)片高劑量組 8 1 5 2△☆ 15.75 ±1.28▲★●◆陽(yáng)性藥物對(duì)照組 8 2 3 3△ 16.25 ±1.03正常對(duì)照組▲★●◇

圖2 大鼠乳腺組織MVD 表達(dá)(免疫組化，×400)

圖3 大鼠乳腺組織VEGF 表達(dá)(免疫組化，×400)

乳腺增生病屬中醫(yī)“乳癖”范疇，由郁怒傷肝、思慮傷脾、氣滯血瘀、痰凝成核，氣、血、痰三者夾雜同時(shí)致病［10］，只是有所偏重之不同，但肝郁氣滯、痰凝血瘀是其基本病機(jī)。乳痛軟堅(jiān)片是我院專家根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而創(chuàng)制，由柴胡、陳皮、延胡索、川楝子、白芍、當(dāng)歸、莪術(shù)、貝母、海蛤粉、黨參、甘草等組成。其中柴胡疏肝和胃、行氣解郁;陳皮理氣調(diào)中、開胃化痰之功，是氣滯痰凝之必用藥;延胡索、川楝子走肝經(jīng)，可行血中之氣滯、氣中之血滯，尤以止痛見長(zhǎng);白芍、當(dāng)歸、莪術(shù)養(yǎng)血活血，破瘀止痛，莪術(shù)還能入血分，活血破瘀兼能調(diào)經(jīng);貝母、海蛤粉化痰軟堅(jiān)散結(jié)，與活血藥物配伍，散結(jié)力增;考慮本病用藥療程長(zhǎng)，恐耗氣傷正，故佐黨參、甘草輔助藥效。諸藥合聚，共奏疏肝解郁、化痰散結(jié)、活血止痛之功，切中乳癖的病因病機(jī)。經(jīng)過多年的研究觀察發(fā)現(xiàn)，乳痛軟堅(jiān)片成分穩(wěn)定［11］，臨床療效確切［12］。藥理研究也發(fā)現(xiàn)乳痛軟堅(jiān)片組方中的柴胡、白芍、莪術(shù)等具有抗炎，解除組織水腫，改善血流變及血管通透性，抗血管生成，抗腫瘤等作用［13］。

通過實(shí)驗(yàn)研究探討發(fā)現(xiàn)，乳痛軟堅(jiān)片可以明顯改善大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，可降低模型大鼠乳腺組織VEGF 表達(dá)，抑制新生血管形成，降低微血管密度(MVD)，改善腺體微循環(huán)，達(dá)到抑制或逆轉(zhuǎn)乳腺增生組織的病理改變，治療乳腺增生的作用。但均顯示出只有在達(dá)到一定劑量時(shí)才顯示出較明顯的作用，且在30 d 的短療程內(nèi)并未使其改變的病理組織變化恢復(fù)到正常，提示中藥與西藥一樣必須達(dá)到一定的血藥濃度方可顯示出療效，并且可能必須達(dá)到一定的持續(xù)作用時(shí)間方可使改變的病理組織變化得以恢復(fù)。但中藥逆轉(zhuǎn)其病理組織改變的趨勢(shì)是值得肯定的。乳腺增生與乳腺癌有顯著關(guān)聯(lián)，屬中度危險(xiǎn)因素，二者都與情志郁結(jié)、痰凝血瘀等因素密切相關(guān)［14-15］，干預(yù)這些病因在阻止乳癖向乳巖發(fā)展中也有著重要作用。乳痛軟堅(jiān)片集疏肝解郁、化痰散結(jié)、活血止痛之功于一體，切中二者的基本病因病機(jī)。也可能正是基于此，其能干預(yù)血管生成，縮小乳房腫塊，在阻止乳腺增生向乳腺癌進(jìn)展這一進(jìn)程中也起著重要作用。

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