響應(yīng)面優(yōu)化大蒜總黃酮提取及抗氧化研究

張 鑫，張海悅，李 鵬，亓付祥

長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長春 130012

大蒜在我國資源豐富，是我們常見的一種香辛料，也是重要的藥用植物，其中含有黃酮類化合物、大蒜素、大蒜精油等多種活性成分［1］。其中黃酮類化合物是普遍存在于植物中天然物質(zhì)，人體內(nèi)不能合成，只能從食物中攝取，對于調(diào)節(jié)生理機能，提高生命運動質(zhì)量，具有極其重要的意義［2］。研究表明，黃酮類化合物具有心血管系統(tǒng)活性、抗菌及抗病毒活性、抗腫瘤活性、抗氧化自由基活性、抗炎、鎮(zhèn)痛活性、保肝等多種生物活性［3］。國外的Koohhui Miean［4］應(yīng)用甲醇溶液提取了大蒜中黃酮類化合物;Anna Maria Nuutila［5］對大蒜總黃酮的抗氧化活性進行了研究。而我國關(guān)于大蒜中黃酮類物質(zhì)的提取及活性研究的報道較少［6］，本實驗采用的超聲波輔助乙醇回流提取法，大蒜中提取出的黃酮沒有刺激性氣味，將來可以作為功能性食品的基礎(chǔ)原料。這對于合理、充分利用豐富大蒜資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮大蒜，市售。試劑:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海友思生物技術(shù)有限公司;無水乙醇、鹽酸、鎂粉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、鄰苯三酚均為分析純;甲醇，色譜純;溴化鉀，光譜純。儀器:JY3002 電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精密試驗設(shè)備有限公司);RE52-98 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);DK-8D 型電熱恒溫水浴鍋(北京光明醫(yī)療儀器廠);UV754 紫外可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司);AB-8 大孔吸附樹脂(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);HF 發(fā)散式循環(huán)超聲提取機(北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 大蒜總黃酮的提取工藝流程

新鮮大蒜剝皮、切碎→烘干→粉碎→超聲波處理→乙醇回流提取→抽濾→黃酮粗提液→濃縮→干燥→大蒜黃酮粉末。

1.2.2 最大吸收波長的確定

取少量純化后的大蒜提取物放在小燒杯中，用20 mL 甲醇溶液將其溶解。用甲醇溶液做空白對照試驗，將樣品溶液在200～800 nm 進行全波長掃描。

1.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［7］

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5 mg(P2O5干燥24 h)，置于50 mL 容量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配置成0.1 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液備用。準(zhǔn)確吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液分別置于10 mL 的容量瓶中，加水2～4 mL，加5%亞硝酸鈉0.4 mL，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁0.4 mL，搖勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉4.0 mL，再加水至刻度、搖勻，放置15 min，以空白試劑作對比參照。用最小二乘法做線性回歸，求得蘆丁濃度(Y)與吸光度(A)的關(guān)系曲線。

1.2.4 單因素試驗

準(zhǔn)確稱取30 g 大蒜粉末，按照一定的料液比，與一定濃度的乙醇溶液中，在一定溫度的超聲波環(huán)境下處理一定時間后，在75 ℃水浴中，回流提取2 h，取出，減壓抽濾。冷卻后，以乙醇溶液為空白樣，在最大吸收波長下測其吸光度，重復(fù)三次，取平均值，選擇最合適的乙醇濃度、料液比、超聲時間和超聲溫度。

1.2.5 響應(yīng)面法對提取工藝參數(shù)的優(yōu)化與驗證

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)之上，分別選擇乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時間(C)、超聲溫度(D)作為自變量，以大蒜總黃酮的得率(A1)作為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面試驗，因素水平取值見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素和水平Table 1 Levels and factors of response surface analysis

1.2.6 鄰苯三酚自氧化法對抗氧化能力的測定

鄰苯三酚自氧化速率的測定［8-10］:取4.5 mL 50 mmol/L 的Tris-鹽酸緩沖溶液(pH 8.2)與4.2 mL蒸餾水混勻后在25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入在25 ℃預(yù)熱過的3 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速搖勻后倒入比色皿中，在320 nm 下每隔30 s 記錄吸光度，計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加，以10 mmol/L 鹽酸溶液作為對照。

加入大蒜黃酮溶液鄰苯三酚自氧化速率的測定:按照上述步驟在加入鄰苯三酚前先分別加入0.1 mL 不同濃度的樣品液，同樣以10 mmol/L 鹽酸溶液作空白對照，測定吸光度。抑制率按下公式計算。

式中:△A1/△t 為鄰苯三酚自氧化時反應(yīng)速率;△A2/△t 為加入樣品液后鄰苯三酚自氧化時反應(yīng)速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

由圖1 看出，大蒜總黃酮提取液在430 nm 附近有最大吸收峰。此后試驗中以430 nm 處的吸光度值來衡量提取效果的差異。

圖1 大蒜提取物的紫外吸收圖譜Fig.1 UV spectrum of garlic extract

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

分別配置一系列濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在430 nm處測定吸光度，參比液為試劑空白，以吸光度為縱坐標(biāo)，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為:Y=10.325X+0.0100，R2=0.9995，表明了蘆丁在濃度0～0.05 mg/mL 之內(nèi)線性關(guān)系最好。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 乙醇濃度的選擇

由圖2(A)可以看出:隨著乙醇濃度的升高總黃酮得率呈上升的趨勢，當(dāng)乙醇濃度達到85%時，總黃酮得率隨著乙醇濃度的增大呈下降的趨勢，因而乙醇的最佳濃度為85%。如果濃度過高，容易揮發(fā)，乙醇濃度依然會降低，得率就會降低。

2.3.2 液料比的選擇

由圖2(B)可以看出:隨著料液比的增加，大蒜中總黃酮得率不斷增大，但當(dāng)料液比大于1∶18 時，總黃酮得率開始下降，因此料液比應(yīng)為1∶18 最好。隨料液比的增大，濃度差提高，有利于傳質(zhì)，所以在總體上表現(xiàn)為料液比增加，總黃酮得率也增高。但這種影響不是無限的，當(dāng)料液比增高達到一定值后總黃酮得率不再增加，這是因為大蒜中總黃酮含量是一定的。

2.3.3 超聲時間的選擇

由圖2(C)可以看出:隨著超聲波作用時間的增加，大蒜總黃酮的得率升高;但當(dāng)時間大于20 min后總黃酮得率趨于平穩(wěn)。所以本實驗選擇超聲時間20 min 為宜。如果超聲時間太長，可能會破壞黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)，使其分解，所以得率反而下降。

2.3.4 超聲溫度的選擇

由圖2(D)可以看出:隨著超聲溫度的升高總黃酮得率呈上升的趨勢，當(dāng)溫度達到55 ℃時，總黃酮得率隨著溫度的升高呈下降的趨勢。因而應(yīng)選用55 ℃左右的溫度進行提取為宜。溫度升高到一定程度會破壞樣品中黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成樣品中黃酮類物質(zhì)的損失，并且會導(dǎo)致提取液的大量揮發(fā)。

圖2 乙醇濃度(A)、料液比(B)、超聲時間(C)及超聲溫度(D)對大蒜總黃酮得率的影響Fig.2 Effects of ethanol concentration (A)，liquid-solid ratio (B)，ultrasonic time (C)and ultrasonic temperature (D)on yield of garlic total flavonoids

2.4 響應(yīng)面法確定大蒜總黃酮的最佳提取條件

2.4.1 響應(yīng)面法試驗設(shè)計及結(jié)果

選擇乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時間(C)及超聲溫度(D)作為自變量，以大蒜總黃酮的得率(A1)作為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Result of response surface design

利用Design Expert 軟件對表2 的數(shù)據(jù)進行回歸分析，擬合后得到A、B、C、D 的二次多項回歸模型為:

A1=-311.23833+4.58450A+5.95750B +1.11767C+2.87083D+1.25000E-003AB-2.00000E-004AC-4.00000E-004AD-2.25000E-003BC-2.00000E-003BD+2.10000E-003CD-0.028567A2-0.18385B2-0.029017C2-0.028367D2

由表3 可知，上述模型的一次項A、B、C、D 為顯著;二次項A2、B2、C2、D2極為顯著;交互項CD 為顯著。模型的F 值為303.85，整體模型的顯著水平P＜0.0001，表明該模型顯著。模型的R2為0.9812，R2(Adj)為0.9934，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小，可以用該方程代替真實試驗點進行分析。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

注:* P＜0.05，＊＊ P＜0.0001。Note:* P＜0.05，＊＊P＜0.0001.

按得到的數(shù)學(xué)模型繪制響應(yīng)曲面圖，各因子的交互作用效應(yīng)可以從響應(yīng)曲面的坡度變化得到反映。響應(yīng)面曲面的坡度的平緩與陡峭程度直接的反映了在處理條件下發(fā)生變化時大蒜總黃酮提取量的響應(yīng)靈敏程度，如果響應(yīng)面曲面坡度相對平緩，表明提取率可以忍受處理條件的變化，響應(yīng)值不敏感;反之，如果響應(yīng)面坡度非常陡峭，表明對于處理條件的變化，響應(yīng)值非常敏感。從圖3 可知，超聲時間與超聲溫度的交互作用較為顯著。

2.4.2 條件優(yōu)化

根據(jù)響應(yīng)面分析表明:最佳提取工藝?yán)碚撝凳且掖紳舛?7.94%，料液比1∶15.69，超聲時間18.01 min，超聲溫度52.73 ℃?？紤]到實際操作的便利，將大蒜中總黃酮提取的最佳工藝條件修正為:乙醇濃度80%，料液比1∶16，超聲時間18 min，超聲溫度53 ℃。按照修正后的條件下進行5 次驗證試驗。結(jié)果如表4 所示，可以得到大蒜總黃酮得率由3.79%上升到3.99%。

表4 試驗驗證相應(yīng)面優(yōu)化條件Table 4 Conformation results of the optimized extraction conditions

圖4 大蒜總黃酮抗氧化功能Fig.4 Antioxidant activity of garlic total flavonoid

2.5 抗氧化實驗的結(jié)果分析

根據(jù)每隔30 s 所測鄰苯三酚自氧化的吸光度和加入大蒜總黃酮后鄰苯三酚自氧化的吸光度作圖，見圖4。經(jīng)計算得:鄰苯三酚自氧化速率ΔA1/Δt=6.47 ×10-3/s;加入大蒜黃酮樣品后鄰苯三酚自氧化平均速率ΔA2/Δt=2.56 ×10-3/s，鄰苯三酚的自氧化速率明顯降低，說明大蒜黃酮具有較強的抗氧化活性。抗氧化試驗測得大蒜黃酮對超氧陰離子自由基()的平均抑制率約為60.43%，說明大蒜黃酮具有一定抗氧化功能。

3 結(jié)論

用超聲波輔助乙醇提取法提取大蒜總黃酮，根據(jù)中心組合設(shè)計原理，采用4 因素3 水平的響應(yīng)面分析，得出了大蒜總黃酮的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明:最佳乙醇濃度為80%，最佳料液比為1∶16，最佳超聲時間為18 min，最佳超聲溫度為53 ℃。采用鄰苯三酚自氧化法對大蒜總黃酮的抗氧化能力進行檢測，發(fā)現(xiàn)大蒜提取液對超氧陰離子自由基()的抑制率為60.43%。

1 Yan MM(閆淼淼)，Xu Z(許真)，Xu C(許蟬)，et al.Progress of functional components in garlic.Food Sci(食品科學(xué))，2010，12:312-318.

2 Wang W(王瑋)，Wang L(王琳).Research progress on flavonoids.J Shenyang Med Coll(沈陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報)，2002，4:115-119.

3 Xu RS(徐任生).Natural Products Chemistry.Beijing:Science Press，2004.

4 Miean KH.Flavonoid content of edible tropical plant.J Agric Food Chem，2001，49:3106-3112.

5 Nuutila AM，Pimia RP，Aarni Mk，et al.Comparison of antioxidant activities of onion and garlic extracts by inhibition of lipid peroxidation and radical scavenging activity.Food Chem，2003，81:485-493.

6 Zhang ZY(張澤英).Optimization of extraction technology of garlic flavones by orthogonal test.J Anhui Agric Sci (安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2009，37:10673-10674.

7 Zhang HY(張海悅)，Zhang SY(張守媛).Optimization of extraction conditions of flavonoids from black sun-flower seed shell by response surface method and its antioxidant properties.China Brew(中國釀造)，2011，9:152-156.

8 Xu SH(許申鴻)，Hang H(杭瑚)，Li YP(李運平).Study and improvement on the pyrogallol autoxidation assay method for SOD activity assay.Chemistry (化學(xué)通報)，2001，8:516-519.

9 Han SH(韓少華)，Zhu JB(朱靖博)，Wang YY(王妍妍).Measurement of the antioxidant activity by pyrogallol autoxidation.China Brew(中國釀造)，2009，6:155-157.

10 Chen M(陳玫)，Zhang DH(張海德).Studies on the antioxidative activities of different solvents extracts from Chinese herbal medicine.J Sunyatsen Univ(中山大學(xué)學(xué)報)，2006，45:131-133.