干鮮人參對PC12 細(xì)胞損傷保護(hù)作用的比較研究

姜宇懋，李宗陽，劉新民，常 琪，張 晶，潘瑞樂*

1吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春 130118;2 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193

人參(Panax ginseng)是大補(bǔ)元?dú)?，安神益智的傳統(tǒng)中藥，其應(yīng)用已超過2000 年的歷史。現(xiàn)代研究表明人參提取物及其活性成分具有明顯的抗抑郁、抗老年性癡呆等中樞神經(jīng)活性［1，2］。由于抑郁癥和老年性癡呆最終都會(huì)引起海馬神經(jīng)元樹突回縮、神經(jīng)元生成受抑、神經(jīng)突觸可塑性遭破壞和神經(jīng)元死亡，導(dǎo)致海馬萎縮，體積縮小等［3，4］。因此，神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)是抗抑郁、抗老年性癡呆藥物共同的作用機(jī)理。干燥人參提取物及其活性成分對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的研究已有很多報(bào)道［5，6］。但目前對鮮人參的研究報(bào)道卻很少。本文擬建立皮質(zhì)酮、谷氨酸和過氧化氫誘導(dǎo)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)細(xì)胞損傷模型，比較干燥和新鮮人參水提液對三種PC12 細(xì)胞損傷的保護(hù)活性，從細(xì)胞水平上評價(jià)干燥和新鮮人參水提液對神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的差異，為人參資源的合理開發(fā)利用及開發(fā)抑郁和老年性癡呆疾病的藥物研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材與試劑

人參(吉林省撫松縣);大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞(協(xié)和細(xì)胞中心);DMEM 高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司);胰蛋白酶、PBS(Solarbio 公司);精制胎牛血清(GiBco 公司);馬血清(元享金馬 公司);谷氨酸(Amresco 公司);MTT(噻唑藍(lán))、皮質(zhì)酮、過氧化氫、DMSO(Sigma 公司);LDH 檢測試劑盒(STANBIO，USA)。

1.2 儀器

超凈工作臺(HDL 公司);CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司);XD-101 型倒置顯微鏡(Olympus，Tokyo);連續(xù)波長酶標(biāo)儀(BIOTEK 公司);離心機(jī)(湖南湘儀，H-1850R);純水儀(美國Millipore 公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

將整株鮮人參平均分成重量相等的二部分，切成薄片。其中一份置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，另一份置-20 ℃冰箱保存作鮮參用。將干、鮮人參片各10 g 分別置于250 mL 圓底燒瓶中，然后再加入200 mL 蒸餾水。于30 ℃超聲儀中提取1 h，過濾，殘?jiān)谜麴s水清洗三次，合并濾液，定容于250 mL容量瓶中，供實(shí)驗(yàn)用。試驗(yàn)液相當(dāng)于0.04 g 干人參/mL。

2.2 PC12 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12 細(xì)胞采用含10%胎牛血清，5%馬血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL 的DMEM 培養(yǎng)液。在37 ℃，5% CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，每2～3 d 換液1 次，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期到70%～80%融合，用0.25%胰酶消化約2 min(37 ℃效果最佳)，1000 rpm 離心4 min，棄去上清液，培養(yǎng)重懸細(xì)胞，以1∶3 的比例傳代。

2.3 PC12 細(xì)胞損傷模型的建立

2.3.1 皮質(zhì)酮誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型的建立

取對數(shù)生長期的PC12 細(xì)胞，以1 ×105/mL 的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，分別加入終濃度為6.25、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L 的皮質(zhì)酮處理，培養(yǎng)24 h 后，MTT 法檢測細(xì)胞活力，利用酶標(biāo)儀在570 nm 處測定各組細(xì)胞吸光度A 值。細(xì)胞存活率=A 處理組/A 對照組×100%。

2.3.2 谷氨酸誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型的建立

取對數(shù)生長期PC12 細(xì)胞，以1 ×105/mL 的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h 后，分別加入終濃度為5、10、15、20、25、30、35 mmol/L 的谷氨酸處理，培養(yǎng)24 h 后，MTT 法檢測細(xì)胞活力。利用酶標(biāo)儀在570 nm處測定各組細(xì)胞吸光度A 值。細(xì)胞存活率=A 處理組/A 對照組×100%。

2.3.3 過氧化氫誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型的建立

取對數(shù)生長期PC12 細(xì)胞以1 ×105/mL 的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，分別加入終濃度為50、100、150、200、250、300、400 μmol/L 的H2O2處理，培養(yǎng)24 h 后，MTT 法檢測細(xì)胞活力。利用酶標(biāo)儀在570 nm 處測定各組細(xì)胞吸光度A 值。細(xì)胞存活率=A處理組/A 對照組×100%。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

取對數(shù)生長期的PC12 細(xì)胞以1 ×105/mL 的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，放入37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，分為10 組(對照組，模型組，4個(gè)干人參水提液組，4個(gè)鮮人參水提液組)，每組4個(gè)復(fù)孔。對照組僅加入100 μL DMEM 培養(yǎng)液;三個(gè)模型組分別加入200 μmol/L 的皮質(zhì)酮、30 mmol/L 的谷氨酸、150 μmol/L 的過氧化氫;干、鮮人參4個(gè)劑量組濃度分別為0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL(以干人參重量計(jì))，首先加入不同濃度干、鮮人參水提取液培養(yǎng)24 h，然后與模型組相同處理，各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用MTT 法檢測細(xì)胞存活率。利用酶標(biāo)儀在570 nm 處測定各組細(xì)胞吸光度A 值。細(xì)胞存活率=A 處理組/A 對照組×100%。

2.5 乳酸脫氫酶活性測定

PC12 細(xì)胞以1 ×105/mL 的密度接種于6 孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h 后加入不同濃度的干、鮮人參水提液作用24 h，最后加入濃度為200 μmol/L的皮質(zhì)酮、30 mmol/L 的谷氨酸和150 μmol/L 過氧化氫損傷細(xì)胞24 h，收集培養(yǎng)細(xì)胞上清液，按照說明書的方法測定LDH 活性。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同濃度皮質(zhì)酮、谷氨酸、過氧化氫對PC12細(xì)胞存活率影響

如圖1 所示，皮質(zhì)酮、谷氨酸、過氧化氫對PC12細(xì)胞的損傷呈濃度和時(shí)間依賴性上升。如圖1A，當(dāng)皮質(zhì)酮濃度為200 μmol/L，與PC12 作用24 h，細(xì)胞存活率為53.42%;如圖1B，當(dāng)谷氨酸濃度為30 mmol/L，與PC12 作用24 h，細(xì)胞存活率為49.64%;如圖1C，當(dāng)過氧化氫濃度為150 μmol/L，與PC12 作用24 h，細(xì)胞存活率為54.27%。所以選擇皮質(zhì)酮為200 μmol/L、谷氨酸為30 mmol/L、過氧化氫為150 μmol/L，作為PC12 細(xì)胞損傷模型的最佳濃度。

圖1 不同濃度皮質(zhì)酮(A)、谷氨酸(B)、過氧化氫(C)對PC12 細(xì)胞存活率的影響(n=5)Fig.1 Effect of different concentrations of corticosterone (A)，glutamic acid (B)and hydrogen peroxide (C)on survival rates of PC12 cells (n=5)

3.2 干、鮮人參對皮質(zhì)酮、谷氨酸、過氧化氫誘導(dǎo)損傷的PC12 細(xì)胞存活力影響

如表1 和表3 所示，MTT 結(jié)果顯示干、鮮人參水提液對皮質(zhì)酮和過氧化氫損傷的PC12 細(xì)胞均有明顯的保護(hù)作用;而表2 顯示干、鮮人參水提液對谷氨酸損傷的PC12 細(xì)胞幾乎沒有保護(hù)活性。同時(shí)，對于皮質(zhì)酮和過氧化氫損傷模型，干、鮮人參水提液在低濃度時(shí)保護(hù)活性組間無顯著性差異;而在中、高濃度時(shí)(0.25、0.5、1 mg/mL)時(shí)均，干、鮮人參水提液對細(xì)胞保護(hù)活性組間表現(xiàn)出顯著性差異(P＜0.01)，表明鮮人參較干人參具有較好的保護(hù)活性。

表1 干、鮮人參水提液對皮質(zhì)酮損傷PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用(n=5)Table 1 Protective effect of the water extract of dry，fresh P.ginseng on corticosterone-induced lesion in cultured PC12 cells (n=5)

注:#P＜0.05 與對照比較;##P＜0.01 與空白對照比較。* P＜0.05 與模型比較;＊＊P＜0.01 與空白模型比較(表2、3 同);模型組劑量單位為μmol/L(表3 同)。Note:#P＜0.05 vs control;##P＜0.01 vs control.* P＜0.05 vs model(the same as in Table 2，3);＊＊P＜0.01 vs model;the dosage unit of model group is μmol/L (the same as in Table 3).

表2 干、鮮人參水提液對谷氨酸損傷PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用(n=5)Table 2 Protective effect of water extract of dry，fresh P.ginseng on glutamic acid-induced lesion in cultured PC12 cells (n=5)

表3 干、鮮人參水提液對過氧化氫損傷PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用(n=5)Table 3 Protective effect of water extract of dry，fresh P.ginseng on hydrogen peroxide-induced lesion in cultured PC12 cells (n=5)

3.3 LDH 活性的測定

乳酸脫氫酶(LDH)是一種可溶性胞質(zhì)酶，存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中，由于細(xì)胞死亡，質(zhì)膜破裂而釋放到培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中LDH 活性的增加與裂解的細(xì)胞數(shù)成正比。如圖2 所示，乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測法，進(jìn)一步證實(shí)了干、鮮人參水提液在皮質(zhì)酮、谷氨酸、過氧化氫模型上所表現(xiàn)出的保護(hù)活性及差異。如圖2B，在谷氨酸損傷模型上，干、鮮水提液在各濃度均不能降低LDH 釋放量;如圖2A、C，在皮質(zhì)酮、過氧化氫損傷模型上干、鮮人參水提液在各濃度均能明顯降低LDH 釋放量且在濃度為0.125 mg/mL 時(shí)無差異，濃度為0.25、0.5、1 mg/mL 時(shí)鮮人參較干人參降低LDH 釋放量更多，在最高濃度1 mg/mL 時(shí)差異最為顯著(P＜0.01)。

圖2 干、鮮人參水提液對皮質(zhì)酮(A)、谷氨酸(B)、過氧化氫(C)誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞LDH 釋放率的影響(n=5)Fig.2 Effect of water extract of dry，fresh P.ginseng on LDH level of corticosterone-induced (A)，glutamic acid-induced (B)and hydrogen peroxide (C)-induced PC12 cells (n=5)

4 討論

本研究采用的PC12 細(xì)胞為大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，經(jīng)誘導(dǎo)具有神經(jīng)元特性，常用于神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)活性的研究［7］。

抑郁和應(yīng)激時(shí)，下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸失調(diào)，GC 分泌增加，而長期接觸高濃度的GC 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成危害，引起海馬神經(jīng)元損傷。皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷是抗抑郁藥物篩選和機(jī)理研究的常用體外模型［8］。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸快速傳遞、學(xué)習(xí)記憶以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起著十分重要的作用，N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體是GLU 受體的一種，過度的激活可引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載繼發(fā)引起線粒體損傷，細(xì)胞能量代謝的障礙，在神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用［9］。H2O2與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，容易透過細(xì)胞膜。與細(xì)胞內(nèi)鐵離子通過FENTON 反應(yīng)形成高活性的自由基，從而誘發(fā)一系列氧化反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞的損傷［10］。本文選用皮質(zhì)酮、谷氨酸和H2O2誘導(dǎo)PC12損傷三種模型，比較了干燥和新鮮人參對這三種細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明干燥和新鮮人參水提液對皮質(zhì)酮和過氧化氫兩種PC12 細(xì)胞損傷模型均有明顯保護(hù)作用，而對谷氨酸損傷模型無保護(hù)作用。

本文的研究發(fā)現(xiàn)人參水提液在較低濃度(0.125 mg/mL)時(shí)，干、鮮人參的對皮質(zhì)酮和過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)活性無明顯差異，當(dāng)濃度為0.25、0.5、1.0 mg/mL 時(shí)，鮮人參水提液對皮質(zhì)酮和過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)活性明顯強(qiáng)于干人參水提液，且在劑量相同時(shí)，干、鮮人參組間存在顯著性差異(P＜0.01)。

干、鮮人參在不同物質(zhì)損傷PC12 細(xì)胞模型上所表現(xiàn)出藥理作用的差異，與細(xì)胞損傷和藥物作用機(jī)制的不同有關(guān)，更與干、鮮人參中所含化學(xué)成分及其比例的不同有關(guān)，如鮮人參中有活性酶，在干人參中則因高溫而變性;鮮人參中所含水溶性氨基酸和蛋白質(zhì)，在干人參中都損失很多［11］;鮮人參中特有丙二?；藚⒃碥?，在干人參中則因高溫使其水解成為相應(yīng)的人參皂苷［12］;鮮人參中所含揮發(fā)油和多糖的含量都較干人參多等。然而，其中相關(guān)水溶性蛋白質(zhì)等成分的差異，則很可能在鮮人參的神經(jīng)保護(hù)活性中起到重要作用［13］。

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