苦豆子多糖的分離純化及初步結(jié)構(gòu)

陳香榮，曹楠楠，吳 艷*，吳金鴻

1山東省煙臺市煙臺山醫(yī)院，煙臺 264001;2 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 陸伯勛食品安全研究中心，上海 200240

苦豆子(Sophora alopecuraides L.)又稱苦豆根、苦甘草(內(nèi)蒙、甘肅)、布亞(新疆)、歐苦參等，是豆科槐屬多年生草本植物，是一種地道的天然中藥，廣泛分布于我國西北及中亞的荒漠化草原和荒漠區(qū)較濕潤的地段，在中國尤以寧夏、甘肅、新疆及內(nèi)蒙古為多［1］。我國對苦豆子的藥用價值記載較多，《本草綱目》對其有詳細(xì)記載，具有“清熱解毒、祛風(fēng)燥濕、抗菌消炎、利尿去火、止痛鎮(zhèn)靜以及殺蟲”等功效，民間用其根治療喉痛、咳嗽、痢疾及濕疹等，用其種子炒制后治療濕疹、癬、瘡癤、白帶過多等［2，3］。

隨著現(xiàn)代藥理藥效學(xué)研究的不斷深入，苦豆子的藥用價值被醫(yī)藥界所公認(rèn)?？喽棺拥闹饕行С煞譃樯飰A、多糖、黃酮、蛋白質(zhì)和有機酸等，目前對苦豆子藥用成分的研究主要集中在生物堿上［4］，但是對于苦豆子多糖的研究較少，現(xiàn)已有報道關(guān)于粗多糖的提取工藝［3，5，6］，而多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)研究鮮見報道。故本文采用水溶醇沉法提取苦豆子粗多糖，利用離子交換層析和凝膠過濾層析對粗多糖進行分離純化，通過氣相色譜(GC)、紫外光譜(UV)以及紅外光譜(IR)等方法對其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)進行研究，旨在為苦豆子多糖的深度開發(fā)及應(yīng)用提供充分的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 原料與試劑

野生苦豆子種子，購于內(nèi)蒙古巴彥淖爾市杭錦后旗;巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品均采購于Sigma 公司;無水乙醇、濃硫酸、苯酚、鹽酸羥胺、乙酸酐、肌醇等均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。DEAE-Sepharose Fast Flow 和Sepharose CL-6B 均購自于瑞典phamacia 公司。

1.2 儀器

DHL-A 電腦恒流泵，上海青浦滬西儀器廠;DBS-100 電腦全自動部分收集器和TH-500 梯度混合器，上海滬西分析儀器廠有限公司;MWCO 12000-14000 Da 透析袋，華美生物工程公司;UV-2100 紫外-可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申生科技有限公司;冷凍干燥機，美國LABCONCO;AB204-S 電子分析天平，METTLER TOLEDO;85L 型離心機，上海市實驗儀器總廠;HD-3 紫外檢測儀，上海青浦滬西儀器廠;2410 HPLC 高效液相色譜儀，美國Waters 公司;GC-14A氣相色譜儀，日本島津公司;EQUINOX 55 傅立葉變換紅外-拉曼光譜儀，德國BRUKER 公司。

2 實驗方法

2.1 苦豆子多糖的提取、分離和純化

將苦豆子粉碎成粒徑約40 目的粉末，在60 ℃下真空干燥至恒重;利用索氏抽提法對苦豆子粉做脫脂處理，然后將粉末晾干，用80%乙醇浸提二次除去料粉中的單糖、多酚、低聚糖和甙類等小分子雜質(zhì)，將料粉晾干待用。

準(zhǔn)確稱取苦豆子預(yù)處理粉，用水作溶劑，根據(jù)前期的實驗結(jié)果［3］，在提取溫度75 ℃、提取時間3 h和水料比25∶1 的條件下提取苦豆子粗多糖，然后在相同條件下再重復(fù)提取1 次，合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器真空濃縮，加4 倍體積的95%乙醇析出多糖，用無水乙醇和丙酮洗滌多次，再將多糖溶入水，冷凍干燥即得苦豆子粗多糖。

采用Sevag 法初步純化除去粗多糖中大量游離的蛋白質(zhì)，用流動自來水透析48 h，蒸餾水透析24h，透析液真空濃縮醇沉，冷凍干燥。利用離子交換柱DEAE-Sepharose Fast Flow(D 2.6 ×30 cm)分離純化，先用0.02 mol/L pH 6.5 磷酸鹽緩沖液洗脫，再用0～1.2 mol/L NaCl 的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫。采用苯酚-硫酸顯色反應(yīng)檢測多糖的含量，用紫外檢測儀在線檢測蛋白質(zhì)的含量，收集各吸收峰的洗脫液，透析并減壓濃縮，冷凍干燥得苦豆子多糖組分為中性多糖SPN 和酸性多糖SPA。

2.2 苦豆子多糖組分的純度鑒定及相對分子質(zhì)量分布的測定

2.2.1 凝膠色譜

用Sepharose CL-6B 凝膠裝柱(1.6 ×100 cm)，用0.1 mol/L NaCl 磷酸鹽緩沖液平衡，柱子流速18 mL/h，每管收集3 mL，用苯酚-硫酸顯色反應(yīng)檢測多糖的含量，用紫外檢測儀在線檢測蛋白質(zhì)的含量，并觀察多糖分離峰的形狀。

2.2.2 高效凝膠滲透色譜(HPGPC)

采用色譜柱Waters UltrahydrogelTMLinear(Φ7.8 mm×300 mm)，檢測器為Waters 2410 示差折光檢測器，以0.1 mol/L NaNO3為流動相，流速為0.9 mL/min，柱溫45 ℃。將相對分子質(zhì)量Mw 分別為6100、26290、84000、158000、291000 和606200 的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品進樣，記錄保留時間T，以T 為橫坐標(biāo)，LgMw 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。根據(jù)待測樣品的保留時間T，通過回歸方程計算多糖樣品的相對分子質(zhì)量。

2.3 苦豆子多糖含量的測定

采用改良的苯酚-硫酸比色法測定多糖的含量［7］。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為葡萄糖濃度c(μg/mL)=199.82A490+10.81，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9975。

2.4 單糖組成分析

將多糖先水解成單糖，取多糖樣品5 mg 于水解管中，加入2 mol/L 的三氟乙酸TFA 溶液于121°C水解2 h，用氮氣除去TFA 后干燥。采用糖腈乙酸酯衍生化法，加鹽酸羥胺、適量肌醇(內(nèi)標(biāo))和吡啶，90 °C 加熱30 min 后取出冷卻，加入醋酸酐，90 °C下繼續(xù)反應(yīng)30 min 進行乙?；?。反應(yīng)產(chǎn)物直接進樣氣相色譜(GC)，根據(jù)出峰時間判斷單糖種類，根據(jù)峰面積的比值確定各單糖間的比例關(guān)系［8］。

氣相色譜工作參數(shù):

采用OV1701 石英毛細(xì)管色譜柱(Φ 0.32 mm×30 m)，載氣為N2，流速1.5 mL/min，F(xiàn)ID 氫火焰檢測器，氣化室溫度260 °C，檢測器溫度250 °C，采用程序升溫，起始溫度150 °C，停留1 min 然后以10°C/min 升溫至190 °C，停留1 min 再以3 °C/min升溫至240 °C，停留20 min。

2.5 紫外和紅外光譜分析

將多糖配成0.5 mg/mL 溶液，置于紫外-可見分光光度計中在波長190～400 nm 進行紫外光譜掃描。

稱取多糖干燥樣品2.0 mg，與KBr 研磨后壓片，在波數(shù)500～4000 cm-1區(qū)域內(nèi)進行紅外光譜掃描。

3 結(jié)果與討論

3.1 苦豆子多糖的提取、分離及純化

苦豆子粗多糖為淺褐色的棉絮狀固體，經(jīng)sevag法初步純化除去游離蛋白質(zhì)后，經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Folw 柱分離純化(見圖1)，獲得兩個洗脫組分分別為組分SPN 和SPA，均為白色纖維狀固體且不含蛋白質(zhì)。組分SPN 是由磷酸鹽緩沖液直接洗脫獲得，即為中性多糖，其得率為粗多糖的61.5%;而組分SPA 是由0～1.2 mol/L NaCl 的磷酸鹽緩沖液線性梯度洗脫獲得，即為酸性多糖，其得率為粗多糖的18.7%。由此可得，苦豆子粗多糖經(jīng)sevag 法除蛋白質(zhì)和DEAE-Sepharose Fast Flow 柱分離純化后總的得率為80.2%。

圖1 苦豆子粗多糖通過DEAE-Sepharose Fast Flow 柱洗脫曲線Fig.1 Elution profile of crude polysaccharides from sophora alopecuraides L.seeds on DEAE-Sepharose fast flow column

3.2 苦豆子多糖組分的純度鑒定及相對分子質(zhì)量分布

苦豆子多糖組分SPN 和SPA 經(jīng)Sepharose CL-6B 凝膠柱層析后，其洗脫曲線見圖2 所示，組分SPN 和SPA 都呈現(xiàn)單一對稱峰，表明二者都為相對分子質(zhì)量均一性多糖。

圖2 苦豆子多糖組分SPN 和SPA 通過Sepharose CL-6B柱的洗脫曲線Fig.2 Elution profiles of SPN and SPA fractions on Sepharose CL-6B column

采用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)對多糖組分SPN 和SPA 的相對分子質(zhì)量分布測定發(fā)現(xiàn)(見圖3和圖4)，組分SPN 和SPA 的洗脫曲線都是對稱性良好的單一峰，這與相應(yīng)的Sepharose CL-6B 凝膠柱層析洗脫結(jié)果一致。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線LgMw=-3.68×10-2T +117 (R2=0.9979)計算出組分SPN 和SPA 的平均相對分子質(zhì)量分別為1.217 ×106Da 和4.412 ×105Da。

圖3 苦豆子多糖組分SPN 的高效凝膠滲透色譜圖Fig.3 Elution profile of SPN fraction on HPGPC column

圖4 苦豆子多糖組分SPA 的高效凝膠滲透色譜圖Fig.4 Elution profile of SPA fraction on HPGPC column

3.3 苦豆子多糖組分的單糖組成

根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)單糖與待測樣品的保留時間確定其單糖的種類(圖略)，根據(jù)各峰面積計算其質(zhì)量比(見表1)。

表1 苦豆子多糖組分SPN 和SPA 的單糖組成Table 1 Monosaccharide compositions of SPN and SPA fractions

從表1 可以看出，苦豆子多糖組分SPN 主要是由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖組成，另外還含有少量的阿拉伯糖，而組分SPA 主要是由甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，另外還含少量的葡萄糖、木糖和鼠李糖，二種多糖組分的各種單糖組成比例不同。

3.4 苦豆子多糖組分的紫外光譜吸收

從苦豆子多糖組分SPN 和SPA 的紫外吸收光譜可看出(見圖5)，二者僅在192 nm 處分別有一個較強的吸收峰，而在波長260 nm 和280 nm 處均沒有吸收峰，表明多糖組分SPN 和SPA 均不含有核酸和蛋白質(zhì)。

圖5 苦豆子多糖組分SPN 和SPA 的紫外吸收光譜圖Fig.5 UV spectra of SPN and SPA fractions

3.5 苦豆子多糖組分的紅外光譜吸收

從苦豆子多糖組分SPN 和SPA 的紅外吸收光譜可看出(見圖6)，二者均具有多糖的特征吸收峰:在3600～3200 cm-1區(qū)域有一個強的寬峰，這是多糖分子內(nèi)和分子間氫鍵上O-H 伸縮振動的結(jié)果;2920 cm-1和2850 cm-1處吸收峰由C-H 伸縮振動引起的;1400 cm-1附近的吸收峰是糖類的C-H 變角振動產(chǎn)生的。在1150～1050 cm-1區(qū)域的吸收峰由多糖中的C-O 變角振動引起的［9］，說明分子中存在C-O-H和糖環(huán)C-O-C 結(jié)構(gòu)。在890 cm-1處吸收峰是β-端基差向異構(gòu)的C-H 變角振動，說明多糖中含有β-糖苷鍵結(jié)構(gòu);在840 cm-1處多糖吸收峰說明多糖中含有α-糖苷鍵結(jié)構(gòu)［10］。

4 結(jié)論

化及其初步結(jié)構(gòu)性質(zhì)。結(jié)果表明，苦豆子多糖經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow 柱分離純化獲得組分SPN 和SPA，二者都是相對分子質(zhì)量均一性多糖，其分子量分別為1.217 ×106Da 和4.412 ×105Da，且均不含有蛋白質(zhì)，這與紫外和紅外所得結(jié)論相一致。氣相色譜測定結(jié)果表明，組分SPN 和SPA 主要含有甘露糖和半乳糖，此外還有葡萄糖、阿拉伯糖、木糖，組分SPA 還含有少量的鼠李糖，但具體單糖質(zhì)量組成比例二者有較大的差異。以上研究結(jié)果為苦豆子多糖的進一步研究以及多糖的開發(fā)提供理論依據(jù)。

圖6 苦豆子多糖組分SPN 和SPA 的紅外吸收光譜圖Fig.6 Fourier transform infrared spectra of SPN and SPA fractions

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