對(duì)葉百部化學(xué)成分液相行為研究

王 昶，陳麗艷，張樹明，魏文峰，王偉明

黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 150036

對(duì)葉百部(Stemona tuberosa Lour.Radix)為較常用中藥，主要用于治療咳嗽、殺蟲，中國(guó)藥典收載了直立百部［S.sessilifolia (Miq.)Miq.］、蔓生百部［S.japonica (Blume)Miq］.及對(duì)葉百部(S.tuberosa Lour.)［1］，其中對(duì)葉百部分布最廣，為臨床主要應(yīng)用品種，同時(shí)，研究表明，其止咳效果優(yōu)于另兩種百部［2］。中國(guó)藥典對(duì)百部的質(zhì)量控制僅限于形態(tài)組織學(xué)研究，具有一定的局限性，故對(duì)百部，尤其是對(duì)葉百部進(jìn)行深入研究十分必要，本文對(duì)對(duì)葉百部生物堿及非生物堿類成分進(jìn)行液相行為的研究，以進(jìn)一步推動(dòng)百部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)范，并可為百部的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

液相色譜:島津2010c 一體機(jī)，雙波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，島津色譜工作站;電子天平:OHAUS 萬(wàn)分之一電子天平，SATORIOUS 十萬(wàn)分之一電子天平;酸度計(jì):PHS-2，上海第二分析儀器廠。

百部藥材:采集自不同產(chǎn)地的對(duì)葉百部，具體見表1，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)研究院王偉明研究員鑒定為對(duì)葉百部;對(duì)照品:金剛大堿鹽酸鹽(croomine hydrochloride)、新對(duì)葉百部堿鹽酸鹽(neotuberostemonine hydrochloride)，實(shí)驗(yàn)室自制。乙腈:色譜純，MERCK公司;液相用水:市售純凈水;其它溶劑均為分析純。

表1 對(duì)葉百部產(chǎn)地及采集時(shí)間Table 1 Origin and harvesting time of S.tuberosa sample

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品溶液制備

取藥材粉末2.5 g，精密稱定，加甲醇100 mL，超聲提取兩次，每次40 min，過(guò)濾，殘?jiān)蛹状?0 mL 分次洗滌，合并濾液和洗液，45 ℃減壓濃縮至干，殘?jiān)蛹状?5 mL 溶解，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2 對(duì)照品溶液配制

分別取金剛大堿鹽酸鹽及新對(duì)葉百部堿鹽酸鹽各5 mg，加甲醇配制成各含0.5 mg/mL 的對(duì)照品混合溶液，此兩種生物堿代表了對(duì)葉百部中生物堿的主要結(jié)構(gòu)類型。

2.3 色譜條件

色譜柱:資生堂MGⅡ(4.6 mm × 250 mm，5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL/min。流動(dòng)相:生物堿檢測(cè)為乙腈、0.02%氨水、水三相組成;非生物堿檢測(cè)為乙腈、0.01%磷酸、水三相組成，二者均采用pH 梯度洗脫。

圖1 不同流動(dòng)相比例對(duì)對(duì)葉百部主要生物堿HPLC 行為的影響Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards of croomine hydrochloride and neotuberostemonine hydrochloride with different ratios of acetonitrile

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)葉百部生物堿成分HPLC 測(cè)定及分析

3.1.1 流動(dòng)相比例變化對(duì)對(duì)葉百部生物堿HPLC行

以金剛大堿鹽酸鹽及新對(duì)葉百部堿鹽酸鹽對(duì)照品混合溶液為樣品，按“2.3”項(xiàng)下HPLC 色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈:0.02%氨水，進(jìn)樣量10 μL，分別調(diào)整氨水的比例依次為45%、50%、55%、60%，結(jié)果如圖1。

由圖1 可知，隨著氨水比例的增加，兩種生物堿色譜峰保留時(shí)間拖后，峰高降低、峰寬增加，但新對(duì)葉百部堿鹽酸鹽色譜峰(峰2)保留時(shí)間拖后要大于金剛大堿鹽酸鹽(峰1)，從圖譜觀察，流動(dòng)相為乙腈:0.02%氨水(45∶55)時(shí)較為適宜。

3.1.2 流動(dòng)相pH 值變化對(duì)對(duì)葉百部生物堿HPLC行為的影響

為考察pH 值變化對(duì)HPLC 行為的影響，分別調(diào)整流動(dòng)相pH 值進(jìn)行檢測(cè)，采用三元洗脫，固定乙腈比例為45%，依次調(diào)整0.02%氨水所占比例為1%、2%、3%、4%、5%、10%，其余為純水相，以金剛大堿鹽酸鹽及新對(duì)葉百部堿鹽酸鹽混合溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖2。

圖2 不同pH 值流動(dòng)相對(duì)百部生物堿色譜行為的影響Fig.2 HPLC chromatograms of mixed standards of croomine hydrochloride and neotuberostemonine hydrochloride under mobile phases with different pH values

從圖可以看出，隨著氨水比例增加，二者色譜峰均呈現(xiàn)尖銳化特征，但金剛大堿鹽酸鹽峰形(峰1)在低堿度條件下明顯好于新對(duì)葉百部堿鹽酸鹽(峰2)，而隨著堿度的增加新對(duì)葉百部堿鹽酸鹽峰形有所改善，通過(guò)此現(xiàn)象可初步推斷，除與使用的色譜柱、柱溫的高低有關(guān)外，不同生物堿結(jié)構(gòu)對(duì)pH 值反應(yīng)存在較大差異，從而影響其HPLC 行為。但二者的保留時(shí)間并未隨pH 變化有明顯改變，此現(xiàn)象尚不能合理解釋。

3.1.3 不同產(chǎn)地對(duì)葉百部生物堿HPLC 圖譜分析

為比較不同產(chǎn)地對(duì)葉百部生物堿成分HPLC 行為差異，選取了5 種不同產(chǎn)地對(duì)葉百部進(jìn)行檢測(cè)(見表1)，樣品處理按“2.1”項(xiàng)下方法，色譜條件根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)確定為乙腈:0.02%氨水(45∶55)，進(jìn)行量10 μL，結(jié)果見圖3。

圖3 不同產(chǎn)地對(duì)葉百部生物堿HPLC 圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of alkaloid components of S.tuberosa from different habitats

從圖中可看出，不同產(chǎn)地對(duì)葉百部生物堿成分HPLC 圖譜差異顯著，本文采用兩種結(jié)構(gòu)的生物堿對(duì)照品進(jìn)行標(biāo)定，根據(jù)色譜峰出峰特點(diǎn)及流動(dòng)相組成可初步判斷圖譜中的主要色譜峰為生物堿類成分，從圖中分析云南產(chǎn)對(duì)葉百部主含金剛大堿，而其它生物堿含量較少，而四川、廣西含有新對(duì)葉百部堿的同時(shí)，還含有較多的其它種類生物堿，這說(shuō)明生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)生物堿的組成及含量有較大影響。

3.2 對(duì)葉百部非生物堿HPLC 測(cè)定及分析

3.2.1 流動(dòng)相比例變化對(duì)對(duì)葉百部非生物堿成分HPLC 行為的影響

取云南產(chǎn)對(duì)葉百部，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸(m/v)-水，其三相的比例分別為10∶40∶50、20∶40∶40、30∶30∶40，結(jié)果見圖4。

圖4 不同流動(dòng)相比例對(duì)對(duì)葉百部非生物堿HPLC 行為的影響Fig.4 HPLC chromatograms of non-alkaloid components of S.tuberosa under mobile phases with different ratios

從圖譜分析，流動(dòng)相中乙腈所占比例對(duì)色譜峰保留時(shí)間影響較大，隨著乙腈比例增加色譜峰保留時(shí)間均有所提前，綜合峰形及保留時(shí)間考慮，流動(dòng)相中乙腈比例為20%時(shí)較為適宜。

3.2.2 流動(dòng)相pH 值變化對(duì)對(duì)葉百部非生物堿HPLC 行為的影響

取云南對(duì)葉百部，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸(m/v)-水，其中乙腈比例為20%，0.01%磷酸比例依次為10、20、25、28、29、30、40、60、80%，其余為水相，結(jié)果見圖5。

圖5 不同pH 值流動(dòng)相對(duì)對(duì)葉百部非生物堿HPLC 行為的影響Fig.5 HPLC chromatograms of non-alkaloid components of S.tuberosa under mobile phases with different values

從圖中可看出，隨磷酸比例增加，色譜峰保留時(shí)間逐漸前移，峰寬變小，說(shuō)明對(duì)葉百部中非堿性成分對(duì)pH 敏感度較高，隨pH 值減低，流動(dòng)相洗脫能力增強(qiáng)，出峰提前。同時(shí)，可看出保留時(shí)間較長(zhǎng)的色譜峰對(duì)pH 敏感度高于保留時(shí)間較短的色譜峰，這為pH 梯度洗脫HPLC 檢測(cè)提供了可能。

3.2.3 采用pH 梯度洗脫進(jìn)行對(duì)葉百部非生物堿部位HPLC 檢測(cè)分析

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)梯度改變流動(dòng)相pH值的方法進(jìn)行對(duì)葉百部非生物堿成分HPLC 檢測(cè)。取5 種不同產(chǎn)地對(duì)葉百部，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品，進(jìn)行HPLC 檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸(m/v)-水，其中乙腈比例為20%，磷酸比例梯度為:0～8 min，10%;8～16 min，20%;16～24 min，30%;24～32 min，40%;32～40 min，10%。結(jié)果見圖6。

圖6 采用pH 梯度洗脫進(jìn)行對(duì)葉百部非堿性部位HPLC分析圖譜Fig.6 pH gradient elution of non-alkaloid components of S.tuberosa from different habitats

從圖中可以看出采用pH 梯度洗脫進(jìn)行百部非堿性部位的HPLC 檢測(cè)，各色譜峰分離度較好，保留時(shí)間多集中在5～25 min 以內(nèi)，可用較短時(shí)間測(cè)定較多的色譜峰，并且圖譜基線較為平直。同時(shí)，從色譜圖比較分析，不同產(chǎn)地對(duì)葉百部非堿性部位的色譜峰相似度較高，各主峰基本可以一致，可用于指紋圖譜鑒別之用。

4 討論

百部生物堿具有吡咯氮雜環(huán)或吡啶氮雜環(huán)母核的獨(dú)特結(jié)構(gòu)骨架，至今已從百部中分離得到100 余種生物堿，而對(duì)葉百部中主要含有對(duì)葉百部堿型及金剛大堿型生物堿［3，4］，實(shí)驗(yàn)表明各產(chǎn)地對(duì)葉百部生物堿組成及含量差異大，不宜以此作為指紋圖譜研究對(duì)象用于對(duì)葉百部的鑒別及質(zhì)量控制。但生物堿屬植物次生代謝產(chǎn)物，其含量及組成與土壤、氣候、光照等地理?xiàng)l件密切相關(guān)［5］，通過(guò)生物堿的組成與產(chǎn)地之間的相關(guān)性研究，可能為對(duì)葉百部產(chǎn)地鑒別提供了一種方法，同時(shí)生物堿作為百部主要藥效成分，也可作為評(píng)判藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要參考。

通過(guò)流動(dòng)相中氨水比例對(duì)百部生物堿HPLC 行為的影響可初步分析，在堿性環(huán)境下，pH 值變化對(duì)色譜峰峰形有顯著影響，大堿度流動(dòng)相中色譜峰峰形尖銳，而流動(dòng)相堿度減低，峰形變差，同時(shí)，不同生物堿對(duì)環(huán)境pH 值反應(yīng)存在較大差異，本實(shí)驗(yàn)中新對(duì)葉百部堿的峰形變化較金剛大堿更加顯著。峰形變差可能是由于生物堿在色譜柱內(nèi)洗脫過(guò)程中擴(kuò)散所致，在高堿度流動(dòng)相中，生物堿在固定相中更為集中，故出峰尖銳，而隨著堿度減低，生物堿在柱內(nèi)擴(kuò)散，峰形變差，而新對(duì)葉百部堿較金剛大堿在固定相的擴(kuò)散程度更易受流動(dòng)相pH 值影響，這可能與其分子結(jié)構(gòu)、自身堿度及pH 值對(duì)分子電子分布的影響等因素有關(guān)，此尚待進(jìn)一步研究。

據(jù)報(bào)道，百部中非堿性成分多為二苯乙烯類及其它酚酸性成分，這類成分已被證明有較好的藥理活性［6］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地對(duì)葉百部的非堿性成分HPLC 圖譜相似度較高，這為進(jìn)行對(duì)葉百部指紋圖譜研究提供了可能，但尚需進(jìn)一步增加樣本量;本實(shí)驗(yàn)中首次進(jìn)行了pH 梯度洗脫HPLC 色譜法應(yīng)用嘗試，采用流動(dòng)相中有機(jī)相與水相組成比例不變，而僅改變流動(dòng)相的pH 值的方式，利用待測(cè)成分對(duì)pH 變化的敏感性而進(jìn)行分離，由于流動(dòng)相中有機(jī)相及水相比例不發(fā)生變化，故基線不產(chǎn)生明顯漂移，而以往改變流動(dòng)相組成的梯度洗脫方法往往存在顯著的基線漂移現(xiàn)象，應(yīng)用此方法在發(fā)揮梯度洗脫優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，更便于色譜峰的比較和計(jì)算。在一些含有酸性或堿性成分的植物藥材中，如黃酮、蒽醌及有機(jī)酸等均對(duì)pH 值變化比較敏感，均可采用此方法鑒別，有較好的應(yīng)用前景，因此在以后研究中將繼續(xù)完善并報(bào)導(dǎo)。

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