鱧腸不同部位抗骨質(zhì)疏松活性及化學(xué)成分比較研究

黃運(yùn)喜，易 駿，吳建國(guó)，鄭淑霞，吳錦忠，吳巖斌*

1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350122;2 福建教育學(xué)院理科部，福州 350001

墨早蓮原名鱧腸，《本草圖經(jīng)》稱為旱蓮草，又稱為金陵草、旱蓮子等［1］。2010 年版《中國(guó)藥典》記載中藥墨旱蓮為鱧腸Eclipta prostrata L.的干燥地上部分，具有滋補(bǔ)肝腎，涼血止血的功效，用于肝腎陰虛，牙齒松動(dòng)，須發(fā)早白，眩暈耳鳴，腰膝酸軟，陰虛血熱吐血、衄血、尿血、血痢、外傷出血［2］;1999 年出版的《中華本草》記載墨旱蓮來(lái)源為鱧腸屬植物鱧腸Eclipta prostrata(L.)L.［verbesina prostrata L.;E.Alba(L.)Hassk.］的全草［3］?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理研究表明，墨旱蓮主要黃酮類、噻吩類和香豆草醚類等化學(xué)成分，具有保肝、止血、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗蛇毒、抗菌、抗氧化和抗骨質(zhì)疏松等生物活性［4-8］。

前人研究墨旱蓮所選用材料為鱧腸全草而非干燥地上部分(墨旱蓮)［9，10］，且在市場(chǎng)流通中的墨旱蓮藥材，?；烊膑k腸的根，而2010 年版《中國(guó)藥典》記載為墨旱蓮為鱧腸干燥地上部位。因?yàn)閷?duì)鱧腸全草或地上部分(墨旱蓮)入藥存在爭(zhēng)議，因此比較鱧腸不同部位的生物活性及化學(xué)成分是否有差異來(lái)評(píng)價(jià)鱧腸根可否與地上部分(墨旱蓮)同時(shí)入藥，對(duì)指導(dǎo)中醫(yī)臨床用藥具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)以成骨細(xì)胞增殖和分化以及墨旱蓮中主要化學(xué)成分皂苷和黃酮的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究鱧腸不同部位抗骨質(zhì)疏松作用和化學(xué)成分的差異，為墨旱蓮在中醫(yī)臨床用藥及其資源利用提供依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 材料

鱧腸E.prostrata 采于福建省莆田市，由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃澤豪副教授鑒定。

大鼠骨肉瘤(UMR106)細(xì)胞由上海第二軍醫(yī)大學(xué)生藥教研室贈(zèng)送。DMEM 高糖培養(yǎng)液，胎牛血清，胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone 公司)，青霉素-鏈霉素雙抗試劑(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司);MTT干粉(美國(guó)Sigma 公司);其余所用藥品和試劑均為分析純。

1.2 主要儀器和試劑

RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-1800 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);DLSB-5/20 低溫冷卻循環(huán)泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);YXQ-LS-70A 立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);移液器(德國(guó)Eppendorf);Anke TDL-50B 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);SW-CJ-1FDA 超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);BCD-518WS A 冰箱(海爾);5417R 高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf);HF212UV CO2 培養(yǎng)箱(Heal Force);TS100 倒置生物顯微鏡(Nikon);ELX800 酶標(biāo)儀(biotek);DK-420 型電熱恒溫水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);AR233CN 電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)。

2 方法

2.1 不同部位提取物的制備

分別稱取鱧腸根，莖，葉按料液比為1 ∶15 用80%乙醇回流提取2 次，每次2 h，合并濾液得提取液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

UMR106 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%新生胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)液中，置37 ℃含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.05%含EDTA 胰酶消化傳代或接種。

2.3 UMR106 細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)

將UMR106 細(xì)胞用含10% 新生胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液配制成密度為5 ×104/mL 的細(xì)胞懸液，以100 μL 每孔的體積接種于96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 后，根、莖、葉三個(gè)部位提取物分別以50、25、12.5 μg/mL 三個(gè)濃度給藥，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)板，各孔加入100 μL 四氮唑藍(lán)(MTT，用PBS 液配制1 mg/mL的MTT 液)，放入培養(yǎng)箱中孵育4 h，取出培養(yǎng)板，在倒置相差顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有條狀黑色沉淀，棄去上清液，每孔加入DMSO(二甲基亞砜)100 μL，DMSO 的顏色變成紫色，把96 孔培養(yǎng)板放于酶標(biāo)儀上震蕩10 min 后使沉淀完全溶解于DMSO，于490 nm 處檢測(cè)各孔A 值。

2.4 UMR106 細(xì)胞的ALP 活性實(shí)驗(yàn)

將UMR106 細(xì)胞用含10% 新生胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液配成密度為5 ×104/mL 的細(xì)胞懸液。以100 μL 每孔的體積接種于96% 培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 后，根、莖、葉三個(gè)部位提取物分別以100、50、25 μg/mL 三個(gè)濃度給藥，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以后每3 天更換一次藥。培養(yǎng)至第8 d 測(cè)定。棄去培養(yǎng)液，PBS 沖洗2～3次，加50 mmol/L 的二乙醇胺100 μL，2.5 mmol/L的對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉50 μL，37 ℃反應(yīng)30 min，最后用0.3 mol/L 的氫氧化鈉100 μL 終止反應(yīng)，于405 nm 處測(cè)A 值［8］。

2.5 皂苷及黃酮含量測(cè)定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取5.1 mg 旱蓮苷A 標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇定容至50 mL，配成0.102 mg/mL 溶液，作為皂苷對(duì)照品溶液。

精密稱木犀草素對(duì)照品20.1 mg，置于100 mL容量瓶中，加入60%乙醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為黃酮對(duì)照品溶液(即0.201 mg/mL)。

2.5.2 皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取旱蓮苷A 對(duì)照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mL 分別置具塞試管中，置水浴上揮去溶劑，加入新配制的1%香草醛-高氯酸溶液0.5 mL，60 ℃水浴中加熱15 min，立即冰水冷卻2 min，加77%硫酸溶液5.0 mL，搖勻，于550 nm 處測(cè)定吸光度。以含量(C)與吸光度(A)進(jìn)行直線回歸，得回歸方程A=0.0336C +0.0007，R2=0.9994(圖1)，線性關(guān)系良好。

圖1 旱蓮苷A 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of ecliptasaponin A

2.5.3 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別吸取標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 mL 于25 mL 容量瓶中，用60%乙醇定容至10 mL，先加5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min;再加10%的硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min;再加4%的氫氧化鈉溶液10 mL，用60%甲醇稀釋至刻度，放置10 min，在波長(zhǎng)512 nm 處測(cè)定吸光度［11］，以含量(C)與吸光度(A)進(jìn)行直線回歸，得回歸方程A=0.0221C-0.007，R2=0.9992(圖2)，線性關(guān)系良好。

圖2 木犀草素標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)曲線Fig.2 The standard curve of luteolin

2.5.4 樣品的皂苷及黃酮含量測(cè)定

精密吸取供試品溶液0.1 mL 置具塞試管中，水浴上揮去溶劑，按2.5.2 項(xiàng)下操作，相應(yīng)試劑隨行空白對(duì)照，于550 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算皂苷的含量。

精密吸取供試品溶液1.0 mL 于25 mL 容量瓶中，按2.5.3 項(xiàng)下操作，在波長(zhǎng)512 nm 處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮含量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間采用單因素方差分析(ANOVA)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 鱧腸不同部位對(duì)UMR106 細(xì)胞增殖的影響

鱧腸根、葉的80%乙醇提取物對(duì)UMR106 細(xì)胞均具有增殖作用，濃度為50 μg/mL 時(shí)作用最強(qiáng)，增殖率分別為7.7%(P＜0.01)，16.9%(P＜0.001)(圖3)，其中葉的提取物增殖對(duì)UMR106 細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng)，且P＜0.001 具有顯著性差異。

圖3 鱧腸不同部位提取物對(duì)UMR106 細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of the extracts from different parts of E.prostrata on UMR-106 cell proliferation.

3.2 鱧腸不同部位對(duì)UMR106 細(xì)胞ALP 活性的影響

鱧腸根、莖、葉的80%乙醇提取物對(duì)UMR106細(xì)胞的ALP 活性均具有促進(jìn)作用，濃度為100 μg/mL 時(shí)作用最強(qiáng)，分別促進(jìn)18.9%(P＜0.001)，20.1%(P＜0.01)，17.0%(P＜0.001)(圖4)。

4 鱧腸不同部位提取物對(duì)UMR106 細(xì)胞ALP 活性的影響Fig.4 Effect of the extracts from different parts of E.prostrata on UMR-106 cell ALP activity

3.3 鱧腸不同部位總皂苷和總黃酮含量

鱧腸根，莖，葉中皂苷含量分別為3.6%，4.0%，2.2%;黃酮含量分別為1.4%，1.4%，3.4%(圖5)。其中鱧腸莖中的皂苷含量最高，而黃酮含量最低;葉中的皂苷含量最低，而黃酮含量最高，根的皂苷、黃酮含量居中。

圖5 鱧腸不同部位總皂苷和總黃酮含量Fig.5 The contents of total saponins and total flavonoids from different parts of E.Prostrata

4 討論

成骨細(xì)胞在骨形成過(guò)程中主要經(jīng)歷成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟、礦化和成骨細(xì)胞凋亡四個(gè)階段［12］。其中，成骨細(xì)胞增殖期成骨細(xì)胞數(shù)量增加，形成多層細(xì)胞，并合成、分泌I 型膠原以便最終可以礦化形成骨結(jié)節(jié);在增殖晚期，成骨細(xì)胞增殖速度減慢，由增殖期進(jìn)入分化期;在分化早期主要是ALP表達(dá)，ALP 是成骨細(xì)胞所分泌的一種同源二聚體糖蛋白，其表達(dá)的強(qiáng)度是識(shí)別和評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞分化程度的早期特異性標(biāo)志，而且表達(dá)隨著細(xì)胞分化的發(fā)展而增強(qiáng)。因此，ALP 被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)早期和中期分化的標(biāo)志［13］。骨代謝中，骨生成與成骨細(xì)胞的增殖與ALP 活性相關(guān)［14］。

墨旱蓮是滋補(bǔ)肝腎的常用中藥，含有多種黃酮和皂苷類成分，其所含的黃酮類成分木犀草素、芹菜素、槲皮素、Dismetin、3'-hydroxybiochanin A 和3'-Omethylorobol 等［7，15，16］均具有一定的抗骨質(zhì)疏松作用。研究結(jié)果顯示鱧腸不同部位乙醇提取物對(duì)UMR106 成骨細(xì)胞增殖和ALP 活性有不同程度的促進(jìn)作用，其中鱧腸根對(duì)成骨細(xì)胞增殖和ALP 活性均有顯著的促進(jìn)作用，對(duì)ALP 活性的促進(jìn)作用與莖和葉的差異并不大?；瘜W(xué)成分分析結(jié)果顯示，鱧腸不同部位總皂苷和總黃酮的含量差異較大，其中根與莖的總皂苷和總黃酮含量差異并不大。

墨旱蓮為鱧腸地上干燥部分，實(shí)驗(yàn)表明，鱧腸的根與鱧腸地上部分有相似的生物活性，這可能也是文獻(xiàn)記載墨旱蓮為醴腸全草入藥的原因［3］。因此，我們認(rèn)為，市場(chǎng)流通中的墨旱蓮藥材中混有少量的醴腸根并不會(huì)影響到墨旱蓮藥材的整體質(zhì)量。另外，雖然已有許多墨旱蓮皂苷和黃酮化學(xué)成分的研究［6，10，17］，但至今其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中仍未有該項(xiàng)目的檢測(cè)，因此建立墨旱蓮總皂苷和總黃酮的測(cè)定方法為其藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供依據(jù)。

1 Li CY(李春洋)，Bai XZ(白秀珍)，Cheng J(程靜)，et al.Hepatoprotective effects of the different ethyl acetate extract of Eclipta Alba.J Math Med (數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志)，2005，18:586-587.

2 Chinese Pharmacopoeia Commission (國(guó)家藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (中華人民共和國(guó)藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.Vol Ⅰ，351-352.

3 The State Administration of Traditional Chinese Medicine“Chinese Materia Medica”Editorial Board(國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)).Chinese Materia Medica(中華本草).Shanghai:The Shanghai Science and Technology Publishing House，1999.Vol ⅡⅩⅠ:818-821.

4 Cheng M(程敏)，Hu ZH(胡正海).Advances in studies on biology and chemical constituents in dried aerial part of Eclipta prostrata.Chin Tradit Herb Druds(中草藥)，2010，41:2116-2118.

5 Shi YY(施嫣嫣)，Yao WF(姚衛(wèi)峰)，Zhang L(張麗)，et al.Antioxidant activity in vitro of different extracts of Eclipta prostrata L.J Shaanxi Coll Tradit Chin Med，2011，34(3):69-70.

6 Lin XH(林雄浩)，Wu JZ(吳錦忠).Research progress of Chinese herbal compound Erzhi pills in chemical constituents and anti-osteoporosis.Pharm J Chin People's Liberation Army(解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào))，2009，25:421-424.

7 Mi Kyeong Lee，Na Ry Ha，Hyekyung Yang，et al.Stimulatory constituents of Eclipta prostrata on mouse osteoblast differentiation.Phytotherapy Res，2009，23:129-131.

8 Lin XH，Wu YB，Lin S，et al.Effects of volatile components and ethanolic extract from Eclipta prostrata on proliferation and differentiation of primary osteoblasts.Molecules.2010，15:241-250.

9 Han Y(韓英)，Xia C(夏超)，Chen XG(陳小硅)，et al.The preliminary research on the chemical components and pharmacological activities of Eclipta prostrata.China J Chin Mater Med(中國(guó)中藥雜志)，1998，23:680-682.

10 Wang ZJ(王自軍)，Xie M(薛梅)，Bian L(邊麗).Ultrasonic extraction and determ ination of total flavonoids and tannin in Eclipta prostrata(L.).Lishizhen Med Mat Med Res(時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥)，2005，16 :759-760.

11 Zhang C(張超)，Yin ZG(尹禮國(guó))，Xu Z(徐洲)，et al.Study on extraction of flavonoids from Fern(Pteridium aquilinum L.).Nat Prod Res Dev (天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，33:28-32.

12 Guo LH(郭呂華)，Yan L(楊嵐)，Du FL(杜發(fā)亮)，et al.The mechanism of kidney-reinforcing chinese herbal mixture in the promoting osteoblast function in vitro.J Pract Stomat(實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志)，2013，29(1):56-60.

13 Wang CT(王昌唐)，Xu L(旭磊)，Chen KM(陳克明)，et al.Effect of puerarin on proliferation and differentiation of osteoblasts in vitro.Chin J Tissue Engin Res (中國(guó)組織工程研究)，2012，16:6102-6106.

14 Yan-Bin Wu，Cheng-Jian Zheng，Lu-Ping Qin，et al.Antiosteoporotic activity of anthraquinones from Morinda officinalis on osteoblasts and osteoclasts.Molecules，2009，14:573-583.

15 Eun Mi Choi.Protective effect of quercitrin against hydrogen peroxide-induced dysfunction inosteoblastic MC3T3-E1 cells.Eep Toxicol Pathol，2012，64:211-216.

16 Zhu RQ(朱瑞清)，Ge BF(葛寶豐)，Yang BJ(楊斌金)，et al.Study on estrogenic efect of genistein and apigenin in vitro.Chin J Chin Mater Med(中國(guó)中藥雜志)，2012，37:2317-2322.

17 Yang YR(楊韻若)，Lu Y(陸陽(yáng)).The chemical constituent and pharmacological activity of Eclipta prostrata.World Phytomedicines(國(guó)外醫(yī)藥·植物藥分冊(cè))，2005，20:10-14.