人參內(nèi)生球毛殼菌株RSQMK-9 的化學(xué)成分研究

梁煒薇，王大成，程 鴻，張明哲，張雅梅*，韋東勝，秦建春*

1吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，長春 130062;2 漢堡大學(xué)生物學(xué)系木材科學(xué)中心，漢堡 21031

植物內(nèi)生菌近年來之所以受到人們的重視是因?yàn)槿藗冎饾u認(rèn)識到它們對寄主植物重要的生態(tài)學(xué)作用及其能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎多變，生物活性顯著的次生代謝產(chǎn)物的巨大潛力。現(xiàn)在，內(nèi)生菌被認(rèn)為是一類開發(fā)潛力巨大的生物資源，尤其是從中可以發(fā)現(xiàn)各種生物活性的天然小分子化合物［1］。人參(Panax ginseng)為五加科名貴藥用植物，作為中草藥已經(jīng)被使用了幾千年，具有抗疲勞、減肥、抗腫瘤和抗氧化等多種保健功效［2］。雖然人參化學(xué)成分和藥理活性研究很多，但是關(guān)于人參內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究還很少，值得進(jìn)一步研究開發(fā)其內(nèi)生菌天然產(chǎn)物。在長期從藥用植物內(nèi)共生菌次生代謝產(chǎn)物中尋找新穎活性化合物過程中［3-6］，我們對東北地區(qū)長白山產(chǎn)的野生人參中分離的一株內(nèi)生真菌RSQMK-9 的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從該菌的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到14個(gè)化合物。在此，我們報(bào)道這些化合物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定以及對海蝦的細(xì)胞毒活性。

1 儀器與材料

熔點(diǎn)儀為XRC-1 型顯微熔點(diǎn)儀，溫度計(jì)未校正。NMR 用BrukerAM-400 和Bruker DRX-500 型核磁共振儀測定(TMS 為內(nèi)標(biāo));EI-MS:70 eV，Varian MAT 731，Varian 311A，AMD-402;ESI-MS:Finnigan Mat-Incos 50，LCQ(Finnigan)。

柱色譜填料:硅膠(青島海洋化工廠);反相填料(Merck RP-18);凝膠填料Sephadex LH-20(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden);大孔樹脂填料Amberlite XAD-16(Rohm ＆ Hass，Paris，F(xiàn)rance);制備TLC 板:Silica gel 60 GF254;TLC 在254 nm 和365 nm 紫外光顯色，并用10%硫酸-乙醇溶液加熱顯色。其余試劑均為分析純。

本實(shí)驗(yàn)所用的內(nèi)生真菌(編號為RSQMK-9)是從人參(Panax ginseng)根部的新鮮組織分離得到，經(jīng)鑒定確定為球毛殼菌(Chaetomium globosum)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 球毛殼菌株RSQMK-9 的液體發(fā)酵

菌株在PDA 培養(yǎng)基上28 ℃活化培養(yǎng)5 d，然后接種在液體培養(yǎng)基(氯化鈣0.2 g，磷酸二氫鉀0.1 g，氯化鉀0.05 g，硫酸鎂0.1 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨15.0g，1000 mL 水，pH7.0)。在1000 mL 的三角瓶中加入400 mL 液體培養(yǎng)基，在26 ℃的搖床上120 rpm 旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)8 d，然后用于提取分離。

2.2 化合物的提取分離

20 L 發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過濾后分別獲得菌絲體和發(fā)酵液。菌絲在50 ℃下烘干粉碎，用丙酮做溶劑超聲提取3 次，合并蒸干溶解在甲醇中，用環(huán)己烷脫脂處理后濃縮得到粗提取物3.5 g，濾液經(jīng)過吸附柱(polymeric resin Amberlite XAD-16)，水洗除去鹽和大分子水溶性物質(zhì)，之后用甲醇洗脫得到非水溶性成分，濃縮后得到5.6 g 提取物，然后將其懸浮于少量水后用石油醚和乙酸乙酯分別萃取3 次，乙酸乙酯萃取相濃縮得2.2 g 萃取物。經(jīng)過TLC 對照，乙酸乙酯萃取物和菌絲部分脫脂后提取物成分基本相同，故將它們合并起來得到總提取物。提取物經(jīng)粗硅膠拌樣后進(jìn)行硅膠層析，用二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，檢測合并得到5個(gè)組分(Fr.1～Fr.5)，F(xiàn)r.2～Fr.4 分別經(jīng)過反復(fù)的硅膠柱層析、RP-18、制備HPLC、Sephadex LH-20 進(jìn)行分離純化得到化合物1～14。

2.3 海蝦致死活性測試

海蝦致死活性采用微量滴定板法，采用豐年蝦(Artemiasalina)幼蟲作為測試生物［7］。在室溫下，直徑1.8 cm，深2 cm 的每個(gè)培養(yǎng)孔中裝入0.2 mL的人造海水，每個(gè)孔中放入人工孵化的游動的豐年蝦幼體30個(gè)。將化合物用DMSO 溶解，定量加入到每個(gè)培養(yǎng)孔中，稀釋到最終10 μg/mL 濃度。對照只加DMSO，每一處理重復(fù)三次。在室溫下黑暗培養(yǎng)24 h 后，在顯微鏡下計(jì)算每個(gè)槽中死亡的海蝦個(gè)數(shù)，最后用以下公式計(jì)算致死率(M)。

其中:M=24 h 后的致死率;A=24 h 后的死亡總數(shù);B=24 h 后對照槽中的死亡總數(shù);N=在加入藥劑之前的死亡數(shù);G=挑選用于測試的小蝦總數(shù)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無色針狀晶體(氯仿)。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ:3.64 (1H，m，H-3)，5.56 (1H，d，J=4.2 Hz，H-6)，5.38 (1H，d，J=6.0 Hz，H-7)，0.62 (3H，s，H-18)，0.96 (3H，s，H-19)，1.03 (3H，d，J=6.4 Hz，H-21)，5.19 (1H，dd，J=15.5，8.0 Hz，H-22)，5.25 (1H，dd，J=15.8 Hz，H-23)，0.93(3H，s，H-25)，0.85 (3H，d，J=6.0 Hz，H-27)，0.84(3H，d，J=6.0 Hz，H-28)。以上數(shù)據(jù)和常見的真菌代謝產(chǎn)物ergosterol［8］數(shù)據(jù)一致，進(jìn)一步通過與麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品比較確定其結(jié)構(gòu)。

化合物2 黃色粉末(氯仿)。1H NMR (CDCl3，500MHz)δ:5.72 (1H，s，H-4)，6.01 (1H，d，J=9.4 Hz，H-6)，6.60 (1H，d，J=9.4 Hz，H-7)，0.95 (3H，s，H-18)，0.98 (3H，s，H-19)，1.05 (3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，5.21 (1H，m，H-22)，5.22 (1H，m，H-23)，0.82 (3H，d，J=7.0 Hz，H-26)，0.84 (3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.92 (3H，d，J=6.8 Hz，H-28);13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:34.1 (C-1)，34.3(C-2)，199.2 (C-3)，123.1 (C-4)，164.2 (C-5)，124.5 (C-6)，133.9 (C-7)，124.6 (C-8)，44.5 (C-9)，36.8 (C-10)，19.0 (C-11)，35.6 (C-12)，44.0(C-13)，155.9 (C-14)，25.3 (C-15)，27.7 (C-16)，55.8 (C-17)，19.0 (C-18)，16.8 (C-19)，39.2 (C-20)，21.2 (C-21)，135.0 (C-22)，132.5 (C-23)，43.0 (C-24)，33.2 (C-25)，20.0 (C-26)，19.8 (C-27)，17.7 (C-28)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］，所以化合物被鑒定為ergosta-4，6，8(14)，22-tetraen-3-one。

化合物3 無色針狀晶體(氯仿)。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:4.07 (1H，m，H-3)，3.62(1H，d，J=4.8 Hz，H-6)，5.35 (1H，dd，J=4.8，2.4 Hz，H-7)，0.59 (3H，s，H-18)，1.09 (3H，s，H-19)，1.03 (3H，d，J=6.7 Hz，H-21)，5.16 (1H，dd，J=15.4，8.0 Hz，H-22)，5.23 (1H，dd，J=15.4，8.0 Hz，H-23)，0.82 (3H，d，J=6.2 Hz，H-26)，0.84(3H，d，J=6.9 Hz，H-27)，0.92 (3H，d，J=6.6 Hz，H-28);13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:32.8 (C-1)，30.4 (C-2)，67.2 (C-3)，39.3 (C-4)，75.9 (C-5)，73.1 (C-6)，117.3 (C-7)，143.2 (C-8)，43.2 (C-9)，37.0 (C-10)，22.0 (C-11)，38.9 (C-12)，43.6(C-13)，54.7 (C-14)，22.9 (C-15)，28.0 (C-16)，55.9 (C-17)，12.3 (C-18)，18.4 (C-19)，40.4 (C-20)，19.6 (C-21)，131.9 (C-22)，135.3 (C-23)，42.8 (C-24)，33.1 (C-25)，19.9 (C-26)，21.1 (C-27)，17.6 (C-28)。通過與文獻(xiàn)中NMR 數(shù)據(jù)比較［9］，確定化合物為cerevisterol。

化合物4 白色晶體(氯仿)。EI-MS(m/z):426［M］+，394，376，299，251，69;1H NMR (600 MHz，CDCl3)δ:3.98 (1H，m，H-3)，6.35 (1H，d，J=8.4 Hz，H-6)，6.54 (1H，d，J=8.4 Hz，H-7)，5.48(1H，m，H-11)，0.78 (3H，s，H-18)，1.19 (3H，s，H-19)，1.05 (3H，d，J=6.8 Hz，H-21)，5.21 (1H，dd，J=15.4，8.0 Hz，H-22)，5.30 (1H，dd，J=15.3，7.4 Hz，H-23)，0.84 (3H，d，J=6.5 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J=6.2 Hz，H-27)，0.98 (3H，d，J=6.8 Hz，H-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的9(11)-dehyoergosterol peroxide 一致［8］，通過進(jìn)一步和標(biāo)準(zhǔn)品比較Rf值(0.49，氯仿∶丙酮=8∶1)確定化合物結(jié)構(gòu)。

化合物5 白色晶體(甲醇)。EI-MS m/z 258［M］+;HR-ESI-MS m/z:259.0607 ［M+H］+，calcd.for C14H11O5259.0602);1H NMR (600 MHz，DMSO-d6)δ:2.63 (3H，s，H-Me)，6.37 (1H，d，J=1.70 Hz，H-4)，6.71 (1H，d，J=2.20 Hz，H-3')，6.62 (1H，d，J=2.20 Hz，H-5')，7.24 (1H，d，J=1.80 Hz，H-6)，11.72 (OH)，10.43(2OH);13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ:138.0 (C-1)，108.9 (C-1')，97.2 (C-2)，152.5 (C-2')，164.6 (C-3)，101.5(C-3')，100.8 (C-4)，158.3 (C-4')，165.4 (C-5)，117.4 (C-5')，104.3(C-6)，138.2 (C-6')，164.0(C-7)，25.1 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［10］，故鑒定化合物為alternariol。

化合物6 橘紅色晶體(氯仿)。ESI-MS m/z 283［M-H］-;1H NMR (600 MHz，CDCl3)δ:12.30(1H，s，1-OH)，7.61 (1H，s，H-4)，7.36(1H，d，J=2.4 Hz，H-5)，7.05 (1H，d，J=1.2 Hz，H-2)，6.67(1H，d，J=2.4 Hz，H-7)，3.97 (3H，s，6-OMe)，2.43(3H，s，3-Me);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:190.8(C-9)，182.0(C-10)，166.5(C-6)，165.2 (C-8)，162.5 (C-1)，148.4(C-3)，135.3 (C-4a)，133.2(C-10a)，124.5(C-2)，121.3(C-4)，113.7(C-9a)，110.3 (C-8a)，108.2 (C-5)，106.8(C-7)，56.1(6-OMe)，22.2(2-Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)一致［11］。故鑒定化合物為physcion。

化合物7 黃色晶體(甲醇)。1H NMR (CD3OD，400 MHz)δ:10.96 (1H，br s，NH)，7.92 (1H，s，H-2)，8.06 (1H，dd，J=2.1，6.0 Hz，H-4)，7.18(2H，m，H-5，6)，7.42 (1H，dd，J=2.1，6.4 Hz，H-7);13C NMR (CD3OD，125 MHz) δ:169.2(COOH)，133.2 (C-2)，108.8 (C-3)，121.9 (C-4)，123.3 (C-5)，122.3 (C-6)，112.8 (C-7)，127.5(C-8)，138.3 (C-9)。經(jīng)過和數(shù)據(jù)庫antibase 以及文獻(xiàn)中Indole-3-carboxylic acid 數(shù)據(jù)比較確定化合物為Indole-3-carboxylic acid［12］。

化合物8 白色結(jié)晶(甲醇)。1H NMR (C5D5N，500MHz)δ:4.42 (1H，m，H-2)，3.02 (1H，m，H-3)，6.96 (1H，s，H-6)，1.29 (3H，d，J=6.4 Hz，2-CH3)，1.23 (3H，d，J=6.6 Hz，3-CH3)，2.39 (3H，s，4-CH3);13C NMR(C5D5N，125 MHz)δ:86.5 (C-2)，44.8 (C-3)，111.8 (C-4)，151.0 (C-5)，104.4(C-6)，140.8 (C-7)，139.8 (C-8)，132.6 (C-9)，21.1 (2-CH3)，19.6 (3-CH3)，12.2 (4-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［13］，故鑒定化合物為2，3，4-trimethyl-5，7-dihydroxy-2，3-dihydrobenzofuran。

化合物9 白色結(jié)晶(甲醇)。EI-MS m/z 136［M］+;ESI-MS m/z:137 ［M+H］+;1H NMR (600 MHz，CD3OD)δ:6.74 (1H，d，J=6.8 Hz，H-3)，7.19 (1H，t，J=16.0 Hz，H-4)，6.58 (1H，t，J=16.0 Hz，H-5)，7.51 (1H，d，J=7.0 Hz，H-6)。經(jīng)過和數(shù)據(jù)庫antibase 以及文獻(xiàn)中anthranilamide 數(shù)據(jù)比較確定化合物為anthranilamide［14］。

化合物10 白色晶體(甲醇)。1H NMR (CDCl3，500 MHz)δ:6.68 (1H，d，J=7.8 Hz，H-3)，7.33(1H，td，J=7.8，1.8 Hz，H-4)，6.69 (1H，t，J=7.8 Hz，H-5)，7.19 (1H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-6);13C NMR (CDCl3，125 MHz)δ:109.6 (C-1)，151.1 (C-2)，116.5 (C-3)，135.1 (C-4)，116.8 (C-5)，132.1(C-6)，173.7 (-COOH)。通過比較化合物和標(biāo)準(zhǔn)品anthranilic acid 在薄層色譜上的顯色情況和Rf值［兩種展開系統(tǒng):正丁醇-醋酸-水(BAW)(4∶1∶5)上層;正己烷6 mL，乙酸乙酯3 mL，另加兩滴冰醋酸］確定化合物為anthranilic acid。

化合物11 淺黃色晶體(甲醇)。ESI-MS m/z 183［M+H］+，HR-ESI-MS (m/z:183.0646 ［M +H］+，calcd.for C9H11O4183.0652);1H NMR (600 MHz，CD3OD)δ:6.19 (1H，s，H-5)，2.44 (3H，s，3-CH3)，2.04 (3H，s，6-CH3)。以上數(shù)據(jù)和antibase中3-methylorsellinic acid (2，4-dihydroxy-3，6-dimethyl-benzoic acid)以及文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)一致［15］。

化合物12 無色結(jié)晶(甲醇)。ESI-MS m/z:183［M+H］+;1H NMR(DMSO-d6，600 MHz):δ3.37(2H，ddd，J=4.5，5.6，11.2 Hz)，3.45 (2H，ddd，J=3.6，8.5，8.8 Hz)，3.57(2H，t，J=7.6 Hz)，3.60(2H，dd，J=11.0，8.8，3.6 Hz)，4.08 (2H，d，J=7.0 Hz，OH)，4.26 (2H，t，J=5.5 Hz，OH)，4.34(2H，d，J=5.6 Hz，OH)。以上數(shù)據(jù)通過和標(biāo)準(zhǔn)品在薄層色譜上比較進(jìn)一步確定mannitol。

化合物13 黃色粉末(氯仿)。ESI-MS (m/z):527［M-H］-，551［M+Na］+，1055［2M-H］-，1079［2M+Na］+，573［M+HCOO］-，1101［2M +HCOO］-;HR-ESI-MS (m/z:529.2687 ［M+H］+，calcd.for C32H37N2O5529.2695);1H NMR (CDCl3，600 MHz)δ:7.03 (1H，s，H-2')，3.75 (1H，br d，J=6.0 Hz，H-3)，7.47 (1H，d，J=7.6 Hz，H-4')，1.88 (1H，d，J=4.4 Hz，H-5)，7.12 ［1H，t(dd)，J=8.4 Hz，H-5'］，7.18 ［1H，t(dd)，J=8.4 Hz，H-6'］，2.73 (1H，d，J=4.6 Hz，H-7)，7.34(1H，d，J=8.0 Hz，H-7')，2.12(1H，br d，J=13.6 Hz，H-8)，2.94(2H，dd，J=14.0，4.0 Hz，H-10α)，2.65(1H，dd，J=14.0，7.5 Hz，H-10β)，1.14(3H，d，J=4.4 Hz，H-11)，1.26(3H，s，H-12)，6.04(1H，dd，J=15.0，10.0 Hz，H-13)，5.22 (1H，m，H-14)，2.23(1H，br d，J=15.0 Hz，H-15)，2.49(1H，m，H-16)，0.97(3H，d，J=6.6 Hz，16-CH3)，5.54(1H，d，J=9.0 Hz，H-17)，1.23(3H，s，18-CH3)，5.03(1H，d，J=4.4 Hz，H-19)，6.49(1H，d，J=16.6 Hz，H-21)，7.67 (1H，d，J=16.6 Hz，H-22)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)一致［16］，確定化合物為chaetoglobosin A。

化合物14 黃色結(jié)晶(甲醇)。ESI-MS m/z:433.1［M+H］+;1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:8.59(1H，s，H-1)，6.75(1H，s，H-4)，6.25(1H，d，J=15.9 Hz，H-9)，6.68(1H，dd，J=15.9，8.2 Hz，H-10)，2.27(1H，m，H-11)，1.39(2H，m，H-12)，0.89(3H，t，J=7.2，H-13)，1.64(3H，s，7-Me)，1.10(3H，d，J=6.6 Hz，11-Me)，3.46(1H，m，H-4')，3.66(1H，m，H-5')，1.06(3H，d，J=6.6 Hz，H-6')，1.04(3H，d，J=7.2，4'-Me);13C NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ:150.7(C-1)，157.0(C-3)，105.0(C-4)，140.1(C-4a)，109.8(C-5)，183.1(C-6)，87.3(C-7)，164.8(C-8)，111.0(C-8a)，120.2(C-9)，146.9 (C-10)，40.1 (C-11)，29.0 (C-12)，12.1 (C-13)，29.8 (7-Me)，19.1 (11-Me)，167.9 (C-1')，125.8(C-2')，200.8(C-3')，50.5(C-4')，69.5(C-5')，21.4(C-6')，12.9(4'-Me)。以上數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)相似［17］，確定化合物為5'-epichaetovirdin A。

3.2 海蝦致死活性測試結(jié)果

化合物13 為毛殼屬真菌產(chǎn)生的細(xì)胞松弛素類生物堿，該類生物堿被報(bào)道具有強(qiáng)烈的抗腫瘤，抗真菌等生物活性［18］;化合物14 屬于真菌來源的azaphilone 類色素，目前報(bào)道的天然azaphilone 類化合物具有抗腫瘤，抗病原細(xì)菌等多種生物活性［19］。細(xì)胞毒活性測試結(jié)果顯示:10 μg/mL 濃度下，處理24 h 后，化合物13 對豐年蝦幼蟲顯示了明顯的毒性，致死率為83.4%;化合物14 也顯示了中等強(qiáng)度的毒性，致死率為54.3%。陽性對照化合物ganodermanontriol 在該濃度下的死亡率為91.2%。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的這兩類真菌代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎多變，活性顯著。值得通過擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模、改變培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件及加入激發(fā)子等手段來進(jìn)一步提高其化學(xué)多樣性，從中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性更強(qiáng)的新化合物。

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