響應(yīng)面法優(yōu)化柿葉總黃酮緩釋微丸的載藥量

王 蘭，顧 欣，趙 麟，龔 頻

陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710021

柿葉為柿科植物柿的新鮮或干燥葉，主要生物活性成分是柿葉中的總黃酮，大量實(shí)驗(yàn)表明其具有明顯的抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗?jié)儭④浕?、降血糖和降血脂等醫(yī)療保健作用［1，2］。響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology，RSM)是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析以尋求最佳工藝參數(shù)，解決多變量的一種統(tǒng)計(jì)方法。

目前，國(guó)內(nèi)研究主要集中于柿葉總黃酮的提取純化方面，而對(duì)于柿葉總黃酮的新劑型還研究甚少。例如董江濤等［3］采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取柿葉中總黃酮的工藝，劉登勇等［4］利用響應(yīng)面法優(yōu)化柿葉總黃酮的超聲波輔助提取條件，蔣橙華等則用微波-超聲協(xié)同輔助提取柿葉中的總黃酮，并且應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)影響提取率的各因素進(jìn)行分析擬合以?xún)?yōu)化工藝參數(shù)，李燕等［5］應(yīng)用AB-8 型大孔樹(shù)脂分離純化柿葉總黃酮。在劑型研究方面，周文亮研制了注射用柿葉總黃酮粉針并考察其安全性，陳惠杰等制備了柿葉總黃酮醇質(zhì)體，至今還尚未見(jiàn)柿葉總黃酮緩釋微丸的相關(guān)報(bào)道。

為了克服傳統(tǒng)劑型給藥次數(shù)較多和血藥濃度波動(dòng)較大的不足，筆者擬制備柿葉總黃酮緩釋微丸;本文將以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以緩釋微丸的載藥量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法分析法優(yōu)化柿葉總黃酮緩釋微丸的載藥量。

1 材料與方法

1.1 材料

柿葉總黃酮(自制，黃酮的含量為55%～60%)，海藻酸鈉(西安中信精細(xì)化工有限公司)，氯化鈣(天津市大陸化學(xué)試劑廠)，殼聚糖(上海三愛(ài)思試劑有限公司)，乙酸(上海建信化工有限公司試劑廠)，氫氧化鈉(西安化學(xué)試劑廠)，無(wú)水乙醇(西安化學(xué)試劑廠)，亞硝酸鈉(北京化學(xué)試劑廠);硝酸鋁(上海新中化學(xué)廠);氯化鈣(天津市大陸化學(xué)試劑廠)。

1.2 主要儀器

HH-S4 型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司);BS224S 型電子天平(北京利多斯儀器系統(tǒng)有限公司);SP-752(PC)型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司);真空冷凍干燥機(jī)(常州品正干燥設(shè)備有限公司);78-1 型磁力攪拌器(國(guó)華電器有限公司);TGL-16M 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 柿葉總黃酮緩釋微丸的制備

首先配制海藻酸鈉溶液，然后加入柿葉中總黃酮的提取物，使其完全溶解于海藻酸鈉溶液中。再分別配制氯化鈣溶液和殼聚糖的乙酸液，將上述的氯化鈣溶液緩慢加入殼聚糖乙酸液中，邊加邊攪拌直至混合均勻。最后將海藻酸鈉-柿葉總黃酮復(fù)合液滴入。在磁力攪拌器中加熱攪拌反應(yīng)，待反應(yīng)完全后，收集微丸，洗滌后干燥。

1.3.2 載藥量的測(cè)定

稱(chēng)取適量的柿葉總黃酮緩釋微丸，在研缽中研細(xì)，置于70%乙醇溶液中浸泡過(guò)夜，再將溶液pH 調(diào)至6.8 左右，在磁力攪拌器作用下攪拌3 h，使藥物充分溶出，然后以3000 rpm 的轉(zhuǎn)速離心10 min 取上清液于510 nm 處測(cè)定吸光度［6］。最后按照以下公式計(jì)算出載藥量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 海藻酸鈉濃度的選擇

固定殼聚糖濃度為2%，氯化鈣濃度為3%，投藥量為20%，攪拌轉(zhuǎn)速為500 rpm，反應(yīng)溫度為40℃，攪拌時(shí)間為30 min，選擇海藻酸鈉濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%，考察海藻酸鈉濃度對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.3.2 殼聚糖濃度的選擇

固定海藻酸鈉濃度為2.5%，氯化鈣濃度為3%，投藥量為20%，攪拌轉(zhuǎn)速為500 rpm，反應(yīng)溫度為40 ℃，攪拌時(shí)間為30 min，選擇殼聚糖濃度依次為1%、1.5%、2%、2.5%、3%，考察殼聚糖濃度對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.3.3 氯化鈣濃度的選擇

固定海藻酸鈉濃度為2.5%，殼聚糖濃度為2%，投藥量為20%攪拌轉(zhuǎn)速為500 rpm，反應(yīng)溫度為40 ℃，攪拌時(shí)間為30 min，選擇氯化鈣濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%，考察氯化鈣濃度對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.3.4 投藥量的選擇

本文以柿葉中總黃酮的提取物為主藥，固定海藻酸鈉濃度為2.5%，殼聚糖濃度為2%，氯化鈣濃度為3%，攪拌轉(zhuǎn)速為500 rpm，反應(yīng)溫度為40 ℃，攪拌時(shí)間為30 min，選擇投藥量依次為10%、20%、30%、40%、50%，考察投藥量對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.3.5 攪拌轉(zhuǎn)速的選擇

固定海藻酸鈉濃度為2.5%，殼聚糖濃度為2%，氯化鈣濃度為3%，投藥量為20%，反應(yīng)溫度為40 ℃，攪拌時(shí)間為30 min，選擇磁力攪拌的轉(zhuǎn)速分別為100、300、500、700、900 rpm，考察攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.3.6 反應(yīng)溫度的選擇

固定海藻酸鈉濃度為2.5%，殼聚糖濃度為2%，氯化鈣濃度為3%，投藥量為20%，攪拌速度為500 rpm，攪拌時(shí)間為30 min，選擇反應(yīng)溫度依次為30、40、50、60、70 ℃，考察反應(yīng)溫度對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.3.7 反應(yīng)時(shí)間的選擇

固定海藻酸鈉濃度為2.5%，殼聚糖濃度為2%，氯化鈣濃度為3%，投藥量為20%，攪拌速度為500 rpm，反應(yīng)溫度為40 ℃，選擇反應(yīng)時(shí)間分別為15、30、45、60、75 min，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化載藥量［7，8］

根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，在確定其余因素的情況下，最終選取海藻酸鈉濃度(A)、殼聚糖濃度(B)、投藥量(C)和反應(yīng)溫度(D)這4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，應(yīng)用Design expert 7.1.6 軟件設(shè)計(jì)4 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸的載藥量進(jìn)行優(yōu)化。因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Levels and code of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 海藻酸鈉濃度對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

由圖1A 可知，柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量隨著海藻酸鈉濃度的增大而增高，當(dāng)海藻酸鈉濃度為2.5%時(shí)達(dá)到最大值，之后載藥量下降。因此，海藻酸鈉濃度以2.5%為宜。

2.1.2 殼聚糖濃度對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

由圖1B 所示，柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量隨著殼聚糖濃度的增大而增高，當(dāng)殼聚糖濃度為2%時(shí)達(dá)到最大值，之后載藥量下降?？紤]到載藥量是望大的，因此，殼聚糖濃度以2%為宜。

2.1.3 氯化鈣濃度對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

區(qū)別于海藻酸鈉濃度和殼聚糖濃度對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響，氯化鈣濃度對(duì)載藥量影響較小。由圖1C 所示，當(dāng)氯化鈣濃度為3%時(shí)載藥量達(dá)到最大，隨后略呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)闅ぞ厶呛吐然}形成瞬時(shí)凝聚珠并不是影響緩釋微丸載藥量的主要因素，綜合上述分析氯化鈣濃度以3%為宜。

2.1.4 投藥量對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

由圖1D 可知，柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量隨著投藥量的增大而增高，當(dāng)投藥量為40%時(shí)達(dá)到最大值，之后載藥量下降。考慮到載藥量是望大的，因此，投藥量以40%為宜。

2.1.5 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

整體而言，攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)載藥量影響較小。由圖1E 可知，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為500 rpm 時(shí)載藥量達(dá)到最大，隨后呈下降趨勢(shì)。因此攪拌轉(zhuǎn)速應(yīng)以500 rpm為宜。

2.1.6 反應(yīng)溫度對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

由圖1F 可知，柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量隨著反應(yīng)溫度的升高而增高，當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)達(dá)到最大值，之后載藥量下降?？紤]到載藥量是望大的，因此，反應(yīng)溫度以50 ℃為宜。

2.1.7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響

整體而言，反應(yīng)時(shí)間對(duì)載藥量影響較小。由圖1G 可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為45 min 時(shí)載藥量達(dá)到最大，隨后呈下降趨勢(shì)。分析可能是反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)不利于緩釋微丸中柿葉總黃酮的溶出。綜合上述分析反應(yīng)時(shí)間以45 min 為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果，最終選取對(duì)響應(yīng)值Y(載藥量)有顯著影響的4個(gè)因素，分別為海藻酸鈉濃度(A)、殼聚糖濃度(B)、投藥量(C)和反應(yīng)溫度(D)，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，應(yīng)用Design expert 7.1.6 軟件設(shè)計(jì)4 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸的載藥量進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2 所示。

圖1 海藻酸鈉濃度(A)、殼聚糖濃度(B)、氯化鈣濃度(C)、投藥量(D)、攪拌轉(zhuǎn)速(E)、反應(yīng)溫度(F)和反應(yīng)時(shí)間(G)對(duì)載藥量的影響Fig.1 Effects of concentration of sodium alginate (A)，concentration of chitosan (B)，concentration of calcium chloride (C)，quantity of reagent (D)，agitation speed (E)，reaction temperature (F)and reaction time (G)on drug loading rate

利用Design expert 7.1.6 軟件對(duì)表2 進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量(Y)對(duì)海藻酸鈉濃度(A)、殼聚糖濃度(B)、投藥量(C)和反應(yīng)溫度(D)的二次多項(xiàng)回歸方程為:Y=21.85 +0.97A +0.64B-0.95C +1.11D +1.2AB-0.28AC+1.3AD+0.2BC-0.73BD+1.16CD-1.38A2-3.58B2-1.15C2-5.5D2。

經(jīng)方差分析可知，模型P 值＜0.0001 為極顯著，說(shuō)明此模型模擬可靠;另外模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9658，說(shuō)明響應(yīng)值Y(載藥量)的變化有96.58%來(lái)源于所選因素;同時(shí)信噪比為17.943，說(shuō)明該模型有很強(qiáng)的信號(hào)。綜上所述，該模型模擬度高、方法可靠。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design matrix and the experimental results

另外海藻酸鈉濃度(A)、投藥量(C)、反應(yīng)溫度(D)、海藻酸鈉平方項(xiàng)(A2)、殼聚糖濃度平方項(xiàng)(B2)、投藥量平方項(xiàng)(C2)和反應(yīng)溫度平方項(xiàng)(D2)對(duì)載藥量(Y)的影響極其顯著。

圖2 A-B(a)、A-C(b)、A-D(c)、B-C(d)、B-D(e)和C-D(f)對(duì)載藥量影響的等高線(C=0)與響應(yīng)面圖Fig.2 Responsive surface plots and contour plots of A-B (a)，A-C (b)，A-D (c)，B-C (d)，B-D (e)and C-D (f)to drug loading rate (C=0)

影響柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的因素按影響大小依次為:反應(yīng)溫度(D)＞海藻酸鈉濃度(A)＞投藥量(C)＞殼聚糖濃度(B)，其交互作用的響應(yīng)面分析結(jié)果依次見(jiàn)圖2 所示。

由2 a-f 可知，海藻酸鈉濃度和殼聚糖濃度的交互作用(記為A-B)、海藻酸鈉濃度和反應(yīng)溫度的交互作用(A-D)以及投藥量和反應(yīng)溫度的交互作用(C-D)對(duì)柿葉總黃酮緩釋微丸載藥量的影響顯著。表現(xiàn)在響應(yīng)面與等高線上即為響應(yīng)面曲面比較陡，并且等高線呈橢圓狀。

2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

對(duì)回歸模型進(jìn)行分析計(jì)算，最終得出當(dāng)海藻酸鈉濃度為2.75%、殼聚糖濃度為2.08%、投藥量為35.94%、反應(yīng)溫度為51 ℃時(shí)載藥量是22.41%。結(jié)果與預(yù)測(cè)值相差不大，說(shuō)明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化柿葉總黃酮緩釋微丸的載藥量是可行的。

3 結(jié)論

本文運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化柿葉總黃酮緩釋微丸的載藥量。以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，結(jié)合Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面分析法依次考察海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、投藥量和反應(yīng)溫度及其交互作用對(duì)載藥量的影響，并且對(duì)回歸模型進(jìn)行驗(yàn)證確定了當(dāng)海藻酸鈉濃度為2.75%、殼聚糖濃度為2.08%、投藥量為35.94%、反應(yīng)溫度為51 ℃時(shí)載藥量是22.41%。另外關(guān)于柿葉總黃酮緩釋微丸體外釋放度的研究可見(jiàn)另文報(bào)道［9］。

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