排風藤提取物中東莨菪苷對神經(jīng)細胞的抗氧化活性研究

孔玉珊，黃少蘭，謝明霞，薛艷紅，鄒 坤，劉士平

天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點實驗室 三峽大學生物與制藥學院，宜昌 443002

排風藤(Solanum cathayanum)又稱千年不爛心、蜀羊泉等，是我國特有的一種茄屬植物，主要分布于三峽流域及神農(nóng)架、恩施和湘西等地［1］。作為一種民間草藥，排風藤具有清熱利濕、解毒消腫的功效，在三峽庫區(qū)具有多年的使用歷史［2］。本實驗室的前期研究表明，排風藤的部分提取物不僅可殺菌抗炎、保肝護膽［3］，而且對神經(jīng)細胞具有較好的抗氧化保護能力［3］，具有可作為治療神經(jīng)退行性疾病(如帕金森癥，阿爾茨海默病和亨廷頓氏病等)藥物的潛能［4］。為進一步探討排風藤提取物在神經(jīng)元氧化損傷中的保護作用，本實驗室從排風藤中分離出9個單體化合物［1，5］，經(jīng)結構鑒定其中一種為東莨菪苷(Scopolin)。本文分析了東莨菪苷的細胞毒性，進行了過氧化氫脅迫下人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y 的氧化損傷保護作用分析，試驗結果表明東莨菪苷具有有效的抗H2O2介導的氧化損傷作用，具有緩解細胞膜損傷、恢復超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)等抗氧化物質(zhì)的含量，為新型神經(jīng)退行性疾病藥物的開發(fā)和設計提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

排風藤采自湖北恩施，經(jīng)三峽大學生物與制藥學院陳發(fā)菊教授鑒定為Solanum cathayanum。人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y 由華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物中心惠贈。

1.2 藥品和儀器

實驗中使用的藥品和試劑有:胰蛋白酶(美國GIBCO 公司)，四氮唑藍(MTT)(美國AMRESCO 公司)，新生小牛血清(杭州四季青生物材料有限公司)，過氧化氫(H2O2，分析純，國藥集團)，LDH、SOD、GSH 檢測試劑盒(上海寶曼生物公司)。其中D-MEM/F-12 完全培養(yǎng)基內(nèi)含2.2 mg/mL NaHCO3，100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素，15%新生小牛血清。基礎培養(yǎng)基將新生小牛血清降為3%。所用的儀器有酶聯(lián)免疫檢測儀(Genios Tecan);CO2培養(yǎng)箱(日本三洋公司)，LD4-2A 離心機(北京醫(yī)用離心機廠)，XDS-1B 倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)和96 孔板(美國Corning 公司)。

1.3 東莨菪苷的分離與鑒定

取6.5 kg 排風藤干燥全草粉碎，95%乙醇回流提取3 次，每次2～3 h，過濾，濾液減壓濃縮至無醇味后用石油醚脫脂。脫脂后的水層用4% HCl 冷浸3 次，用Na2CO3調(diào)至成不同的pH(7、10、12)后經(jīng)氯仿萃取三次，最后水層再用正丁醇萃取得正丁醇部位(260.2 g)。將正丁醇部位水懸浮后，其水溶部分經(jīng)大孔吸附樹脂和反相硅膠柱層析，經(jīng)HPLC 制備獲得30 mg 樣品。將該化合物進行硅膠薄層色譜、重氮化氨基苯磺酸反應、Molish 反應和核磁共振后確定其結構。

1.4 細胞培養(yǎng)及H2O2損傷模型的建立

SH-SY5Y 細胞用D-MEM/F-12 完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。待細胞80%～90% 鋪滿瓶底時進行傳代、轉板，貼壁細胞用0.25%的胰蛋白酶進行消化，傳代按1∶3 比例進行。H2O2損傷模型的建立按照［3］的方法進行。

1.5 東莨菪苷對神經(jīng)細胞毒性檢測

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y 細胞以1 ×105個/mL 的濃度接種于96 孔板，100 μL/孔，培養(yǎng)24 h 貼壁后棄去舊培養(yǎng)基，加入濃度為0.1、1、10、100、1000 μM 的藥物(含3%血清的培養(yǎng)基配制)，同時設空白對照組，每組設6 次重復，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，MTT 比色法在492 nm 處檢測吸光值并計算細胞存活率［6-8］(存活率=處理組OD 值/空白組OD 值×100%)。

1.6 東莨菪苷對神經(jīng)細胞抗氧化保護活性及量效關系分析

根據(jù)毒性實驗結果，選取100 μM 以下的濃度先進行初篩。棄去舊培養(yǎng)基后，模型組及給藥組加入濃度為700 μM 的雙氧水(無血清培養(yǎng)基配制)，培養(yǎng)12 h 后用MTT 比色法檢測細胞存活率。量效關系分析中將濃度設置為0.01、0.1、1、10、100 μM，同時設空白組、模型組及正對照維生素E(VE)組(VE 的濃度為5 mg/mL)。

1.7 乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)檢測

利用黃遞酶法分別檢測細胞內(nèi)外的LDH，計算漏出率。LDH 漏出率=［細胞外值/(細胞外值+細胞內(nèi)值)］×100%。LDH、SOD、GSH 檢測的具體操作均按上海寶曼生物公司的試劑盒說明進行。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果與分析

2.1 東莨菪苷的結構鑒定

分離純化后的樣品呈白色粉末狀，mp.203～204 ℃。硅膠薄層色譜在365 nm 紫外燈下觀察呈藍色熒光斑點，UVλMeOHnm:203 nm、275 nm，提示該化合物有較大的共軛體系，重氮化氨基苯磺酸反應呈陽性，提示該化合物可能是香豆素類化合物。Molish 反應呈陽性，原位酸水解只檢測到葡萄糖。ESIMS m/z:355 ［M+H］+。1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)δH:7.97 (1H，d，J=9.5 Hz，H-4)，7.29 (1H，s，H-8)，7.16 (1H，s，H-5)，6.33 (1H，d，J=9.5 Hz，H-3)，5.00 (1H，d，J=6.0 Hz，H-1')，3.81(3H，s，6-OCH3);13C NMR (DMSO-d6，100 MHz)δC:160.4 (C-2)，149.8 (C-7)，148.8 (C-9)，145.9(C-6)，144.1 (C-4)，113.4 (C-5)，112.2 (C-10)，109.6 (C-3)，105.5 (C-8)，102.9 (C-1')，77.0 (C-3')，76.2 (C-5')，72.9 (C-2')，69.5 (C-4')，60.6(C-6')，55.9 (6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］報道一致，故鑒定化合物為東莨菪苷(scopolin)，其化學結構式見圖1。

圖1 東莨菪苷的化學結構Fig.1 Chemical structure of scopolin

2.2 東莨菪苷對神經(jīng)母瘤細胞生長的影響

為明確東莨菪苷對神經(jīng)細胞的生長是否具有毒害作用，并尋找到合適的藥物濃度范圍，試驗中我們考察了不同濃度的單體對SH-SY5Y 細胞存活率的影響。結果顯示(表1)東莨菪苷對SH-SY5Y 細胞的毒性作用隨著濃度的增加而增強:當濃度達到100 μM 時，細胞的生長會受到影響;而當濃度升高到1000 μM 時，細胞的存活率僅有對照的82.23%。統(tǒng)計分析還表明，當用0～100 μM 濃度的東莨菪苷進行處理時，其對SH-SY5Y 細胞的毒害作用較小，因此選用此濃度范圍進行抗氧化保護作用分析。

表1 東莨菪苷對SH-SY5Y 細胞生長的影響Table 1 Effect of scopolin on growth of SH-SY5Y cells

2.3 東莨菪苷的抗氧化能力分析

在建立了700 μM 雙氧水氧化脅迫模型的基礎上，我們分析了東莨菪苷對人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y 的抗氧化活性分析。MTT 比色法實驗結果顯示東莨菪苷對雙氧水損傷的SH-SY5Y 細胞具有明顯的保護作用。在0.01～100 μM 濃度范圍內(nèi)東莨菪苷均顯示出很好的抗氧化活性，保護細胞免于遭到雙氧水的氧化損傷，其效果優(yōu)于陽性對照VE(圖2)。但在所試驗的濃度范圍內(nèi)，其量效關系不明顯。

圖2 東莨菪苷對SH-SY5Y 細胞的抗氧化保護作用Fig.2 Protective effect of scopolin on SH-SY5Y cells under H2O2oxidative stress

2.4 LDH、SOD、GSH 檢測

為進一步分析排風藤提取物東莨菪苷對神經(jīng)細胞的氧化保護作用機理，我們分別測定了SH-SY5Y細胞在不同東莨菪苷濃度(0.001、0.01 和0.1 μM)下的LDH、SOD、GSH 值(圖3)。實驗結果表明，在細胞正常生長時，LDH 的活性主要集中在細胞內(nèi)，可700 μM 的H2O2使得LDH 的漏出率達到近30倍(圖3A)，即H2O2導致神經(jīng)細胞的氧化損傷部分原因是由于細胞膜受損，使得胞內(nèi)LDH 的活性降低，胞外LDH 活性增高。但東莨菪苷可與陽性對照VE 一樣，起到部分降低LDH 漏出率的作用，在濃度超過0.01 μM 時效果明顯(圖3A)，說明東莨菪苷可以降低因H2O2導致的細胞膜損傷，從而起到保護神經(jīng)細胞的作用。

在H2O2存在下，SH-SY5Y 細胞的SOD 酶活顯著下降(圖3B)。VE 可以顯著恢復其活性(恢復率:68%)，而東莨菪苷對其也有很好的恢復效果(圖3B)，在0.1 μM 時SOD 酶活可以恢復到正常生長的63%。GSH 活性檢測的結果和SOD 類似，H2O2使得GSH 的活性下降80%以上(圖3C)，VE和0.1 μM 的東莨菪苷使得其活性得以部分恢復，恢復度達40%以上(圖3)。這一系列實驗結果表明，東莨菪苷對神經(jīng)細胞的抗氧化保護作用，除了可以減少膜損傷之外，還可以顯著提高抗氧化酶的活性。

3 討論

活性氧可誘導神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡，是造成許多退化性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一種重要誘因。故找到合適的抗氧化劑，保護神經(jīng)元免受氧化應激損傷，是防治該類疾病的有效途徑。前期研究表明排風藤的提取物對神經(jīng)細胞具有較好的抗氧化保護能力［3］，本文在前期研究的基礎上從排風藤中分離了一個單體化合物——東莨菪苷，并探討了其對神經(jīng)母瘤細胞SH-SY5Y 的抗氧化保護活性，結果表明在0.01～100 μM 濃度范圍內(nèi)東莨菪苷均顯示出很好的抗氧化活性，其效果甚至優(yōu)于陽性對照VE，因此為神經(jīng)退行性疾病的藥物設計提供了一定的參考價值。

圖3 東莨菪苷對神經(jīng)細胞LDH 漏出率(A)、SOD 酶活(B)及GSH(C)活性影響Fig.3 Influence of scopolin on LDH leakage (A)，SOD (B)and GSH (C)activities of SH-SY5Y cells

作為一種潛在藥物，東莨菪苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛的效果，可用于治療風濕痛和神經(jīng)痛等疾病，顯示出很大的潛在藥用價值［1-3］。但是其對神經(jīng)細胞的抗氧化保護作用機理卻很復雜，本文研究結果表明，東莨菪苷既可以一定程度上保護細胞膜免遭損傷，又可以恢復神經(jīng)細胞抗氧化酶(SOD)或抗氧化劑(GSH)的活性，這些生理指標均接近正對照VE。其中，不管是VE 還是東莨菪苷，其對SOD 和GSH的恢復度均分別可達到正常生長的60%和40%(圖3);相比之下，東莨菪苷和VE 對LDH 漏出率的作用有限，是正常生長的15～20 倍(圖3)，反映細胞膜的損傷度仍較高。這一些說明東莨菪苷介導的神經(jīng)細胞的抗氧化作用，機制復雜多樣，其詳細機理還有待進一步研究。

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