禹州漏蘆醇提物對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的影響

李喜鳳，胡春月，胡利欣，方曉艷，唐 露，張偉曉，安 碩，王優(yōu)湑

河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046

禹州漏蘆為菊科植物藍(lán)刺頭屬(Echinopslatifolius Tausch)或華東藍(lán)刺頭(Echinopsgrijisii Hance)的干燥根［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品，為河南傳統(tǒng)的道地藥材。文獻(xiàn)報(bào)道禹州漏蘆主要含有噻吩類、揮發(fā)油類及三萜類等化學(xué)成分，其中噻吩類具有抗炎、保肝、抗腫瘤的作用［2，3］，但對于禹州漏蘆藥材的藥效學(xué)目前無人進(jìn)行系統(tǒng)的研究。該文采用CCl4小鼠急性肝損傷模型，對禹州漏蘆藥材的醇提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，為禹州漏蘆藥材藥用資源的合理開發(fā)和臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

昆明種小鼠60 只，雌雄各半，體質(zhì)量為(20 ±2)g，河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號SCXK(豫)2010-0001。

1.2 藥品與試劑

禹州漏蘆藥材采自新鄉(xiāng)市輝縣，經(jīng)本院生藥學(xué)科董誠明教授鑒定為菊科藍(lán)刺頭屬植物藍(lán)刺頭單個(gè)品種。陽性對照藥:聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江萬邦藥業(yè)有限公司);SOD(批號:20111215)、MDA(批號:20111215)、GSH-PX(批號:20111214)、考馬斯亮蘭蛋白(批號:20111109)、ALT(生產(chǎn)批號:20111230)、AST(生產(chǎn)批號:20111230)，測定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;四氯化碳(開封市試劑總廠);其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

LDZA-0.8 型低速自動平衡微型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);UV-2000 型紫外分光光度儀(上海尤尼柯);數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海比郎儀器有限公司);FA2004B 電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司);DF-1 集熱式恒溫磁力攪拌器(金壇市中大儀器廠)。

1.4 樣品的制備

禹州漏蘆藥材，經(jīng)粉碎后充分混合，過2 號篩，用95%乙醇加熱回流提取，加10 倍量提取3 h 后再加入8 倍量提取3 h，第三次6 倍量提取2 h，合并3次提取液，揮干，加水配置成醇提物高劑量(425.21 mg/kg)、醇提物中劑量(231.94 mg/kg)、醇提物低劑量(119.70 mg/kg)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CCl4致小鼠急性肝損傷模型的建立

本實(shí)驗(yàn)采用0.2% CCl4油溶液，以10 mL/kg體重腹腔注射的方法建立急性肝損傷模型。0.2%CCl4油溶液要現(xiàn)用現(xiàn)配，恒溫磁力攪拌器攪拌6 h。因CCl4與油溶液不易互溶，必須充分混勻，減少造模誤差。

2.2 動物分組及實(shí)驗(yàn)流程

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為6 組，每組10只:空白組、模型組、陽性藥組、禹州漏蘆醇高、中、低劑量組。正常組及模型組給予生理鹽水，陽性組給予聯(lián)苯雙酯滴丸(25 mg/kg)，禹州漏蘆醇提物高、中、低劑量組灌胃給藥，每天一次，連續(xù)7 d，于末次給藥1 h 后，正常組給予腹腔注射花生油，其余組給予腹腔注射0.2% CCl4花生油溶液10 mL/kg，禁食不禁水。灌胃期間，供給小鼠食用河南省實(shí)驗(yàn)中心提供的標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲用純凈水。觀察記錄各組小鼠實(shí)驗(yàn)前后的體重及精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤、食欲排泄等一般情況。造模16 h 后摘眼球取全血，3000 rpm 離心15 min，血清冷藏，待測。取血后，快速脫頸椎處死。剖腹取肝臟，測定每只小鼠的肝臟濕重。取肝右葉組織0.5g 左右，用冷生理鹽水沖洗，濾紙拭干，用生理鹽水制成10%肝組織勻漿，離心，取上清待測。同時(shí)取肝左外葉相同部位，固定于10%甲醛溶液中，經(jīng)取材修塊，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片厚度4 μm，HE 染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

2.3 生化指標(biāo)的檢測

ALT、AST 活性測定采用賴氏法;MDA 含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法;SOD、GSH-Px活性測定分別采用亞硝酸鹽法和5，5-雙硫代對硝基苯甲酸(DTNB)顯色法。

2.4 組織病理學(xué)觀察

根據(jù)實(shí)驗(yàn)各組肝細(xì)胞變性的不同程度，共分為4 級，擬定標(biāo)準(zhǔn)如下:0 級(-)，肝組織結(jié)構(gòu)正常，無明顯變性，壞死及炎癥細(xì)胞浸潤;1 級(+)，肝小葉結(jié)構(gòu)尚正常，可見氣球樣變或脂肪變性，散在點(diǎn)狀壞死;2 級(++)，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，可見明顯的灶狀壞死，伴有炎癥細(xì)胞浸潤;3 級(+++)，肝小葉結(jié)構(gòu)不清、可見明顯的片狀壞死，伴有區(qū)域性炎癥細(xì)胞浸潤。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以表示;組間比較采用t 檢驗(yàn)，等級資料進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組小鼠的一般情況

連續(xù)觀察7 d，各組小鼠在造模前，除個(gè)別幾只雄鼠有掐咬現(xiàn)象，飲食、活動、精神狀態(tài)，皮毛、大小便等均無異常變化，造模后，大部分小鼠出現(xiàn)倦縮，豎毛懶動、稀樣便等異常情況出現(xiàn)。與正常組比較，實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠的體重?zé)o顯著性差異(P ＞0.05)，造模后，與正常組比較，模型組的小鼠肝臟系數(shù)值(小鼠肝臟濕重/處死前小鼠體重)顯著性增大(P ＜0.01)，禹州漏蘆醇提物的高中低劑量組肝臟系數(shù)均較模型組顯著降低(P ＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)前后小鼠的體重變化及肝臟系數(shù)(x± s，n=10)Table 1 Changes of weight and liver coefficient of micebeforeand after experiment(，n=10)

表1 實(shí)驗(yàn)前后小鼠的體重變化及肝臟系數(shù)(x± s，n=10)Table 1 Changes of weight and liver coefficient of micebeforeand after experiment(，n=10)

注:與正常組比較，##P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:##P ＜0.01 vs normal control group;* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs liver injury model group.The same as follow.

3.2 禹州漏蘆醇提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型血清中ALT、AST 的影響

與空白組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST 活性顯著升高(P ＜0.01)，顯示造模成功。與模型組比較，禹州漏蘆醇提取物各劑量組對小鼠血清中ALT、AST 含量均有不同程度的降低，具有顯著性差異(P ＜0.05，P ＜0.01)。結(jié)果見表2。

表2 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠血清中AST 和ALT 的影響(x± s，n=10)Table 2 Effect of alcohol extract ofRadix Echinopsison serum ASTand ALT in liver injurymice(，n=10)

表2 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠血清中AST 和ALT 的影響(x± s，n=10)Table 2 Effect of alcohol extract ofRadix Echinopsison serum ASTand ALT in liver injurymice(，n=10)

3.3 禹州漏蘆醇提取物對CCl4致小鼠急性肝損傷模型肝組織中SOD、GSH-Px、MDA 的影響

與空白組比較，模型組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px 活性顯著降低，MDA 水平顯著增加(P ＜0.05)，顯示造模成功。與模型組比較，禹州漏蘆醇提物各劑量組對小鼠肝組織中SOD、GSH-Px 活性顯著升高，MDA 水平顯著降低(P ＜0.05)。結(jié)果見表3。

表3 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠肝勻漿SOD、GSH-Px 和MDA 的影響(，n=10)Table 3 Effect of alcohol extract of Radix Echinopsis on the activity of SOD，GSH-Pxand MDA in livertissue of acute injury mice(，n=10)

表3 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠肝勻漿SOD、GSH-Px 和MDA 的影響(，n=10)Table 3 Effect of alcohol extract of Radix Echinopsis on the activity of SOD，GSH-Pxand MDA in livertissue of acute injury mice(，n=10)

3.4 禹州漏蘆醇提物對CCl4致急性肝損傷模型小鼠的肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

3.4.1 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠肝組織的影響

通過對實(shí)驗(yàn)各組小鼠肝細(xì)胞變性情況進(jìn)行半定量分析，結(jié)果表明，空白組小鼠肝細(xì)胞無異常改變;模型組小鼠肝細(xì)胞變性程度嚴(yán)重，經(jīng)Ridit 分析，與空白組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);禹州漏蘆醇提物各劑量及陽性組小鼠肝細(xì)胞變性程度均有所改善，其中尤以陽性藥組，高、中劑量組效果最佳，與模型組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，且禹州漏蘆高中劑量組能夠顯著性的降低肝臟系數(shù)(P ＜0.05)，結(jié)果見表4。

表4 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠肝組織的影響(，n=10)Table 4 Effect of alcohol extract ofRadix Echinopsis on the denaturation liver(，n=10)

表4 禹州漏蘆醇提物對肝損傷小鼠肝組織的影響(，n=10)Table 4 Effect of alcohol extract ofRadix Echinopsis on the denaturation liver(，n=10)

3.4.2 禹州漏蘆醇提物對各組小鼠病理切片光鏡觀察

空白組小鼠肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心，成輻射狀排列，匯管區(qū)可見小葉間血管和膽管，肝細(xì)胞無變性、壞死等損傷性改變;模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，中央?yún)^(qū)肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的水樣變性或脂肪變性，甚至壞死，伴炎癥細(xì)胞浸潤;陽性組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，但肝小葉中央?yún)^(qū)肝細(xì)胞排列紊亂，可見肝細(xì)胞水樣變性或脂肪變性，偶見壞死，伴炎癥細(xì)胞浸潤;禹州漏蘆醇提物給藥組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，與模型組比較，禹州漏蘆醇提取物不同程度地減少CCl4誘導(dǎo)肝損傷中肝細(xì)胞中的炎性細(xì)胞浸潤、水腫、變性、壞死等。切片結(jié)果見圖1。

圖1 禹州漏蘆醇提物對小鼠急性肝損傷的肝組織病理切片的光鏡觀察(HE 染色，×100)Fig.1 Light microscopic images of biopsies of liver tissues from different groups’acute liver injury mice

4 討論與結(jié)論

肝損傷是現(xiàn)代研究護(hù)肝藥物作用及作用機(jī)制常用病理模型?；铙w動物上應(yīng)用CCl4復(fù)制急性肝損傷模型是一個(gè)經(jīng)典方法［4］，其病理過程與肝毒物引起人體肝損傷的病理過程極其相似［5］。CCl4進(jìn)入肝細(xì)胞后，經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P450 激活，生成自由基(·CCl3等)，繼而引起生物膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致肝脂肪變和肝壞死［6］。而且當(dāng)肝細(xì)胞膜因脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而結(jié)構(gòu)破壞、功能受損時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的ALT、AST 等會釋放到血液中，從而血清中ALT、AST的活性檢測可以評價(jià)肝臟損傷的程度和藥物治療肝損傷的效果［7，8］。自由基是人體正常生物化學(xué)過程中的中間產(chǎn)物，在機(jī)體正常及病理過程中均存在，同時(shí)機(jī)體中亦存在可滅活氧自由基的酶，如SOD、GSH-Px 等，SOD 的含量水平可作為衡量機(jī)體抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn);GSH-Px 能夠特異地催化還原性GSH對過氧化氫的還原反應(yīng)，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的完整作用。MDA 可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、破裂及壞死。因此，ALT、AST、MDA含量和GSH-Px、SOD 活性間接反映了肝細(xì)胞受自由基攻擊后損傷的程度，它們的變化可以作為自由基致肝細(xì)胞損傷的一種靈敏可靠的診斷性指標(biāo)及預(yù)后療效的觀察;同時(shí)肝臟活檢能夠直觀的顯示肝臟實(shí)質(zhì)性損害、炎癥活動及纖維化。

CCL4是毒性化學(xué)制劑，其誘導(dǎo)的肝損傷模型能準(zhǔn)確反映肝細(xì)胞功能、代謝及形態(tài)學(xué)變化，經(jīng)濟(jì)且重復(fù)性好。但CCL4同時(shí)也會損傷動物的心、脾、肺、腎、腦等器官;另外，蒸汽和液體可由呼吸道、皮膚吸收，對人體有一定的毒性，故在配置CCL4油溶液及腹腔注射造模的時(shí)候一定要謹(jǐn)慎操作。

本課題采用經(jīng)典的化學(xué)性肝損傷動物模型［9］，從生化指標(biāo)顯示，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M的AST、ALT 活性，MDA 含量升高明顯高于空白組，同時(shí)GSH-Px、SOD活性降低;表明造肝細(xì)胞損傷模型成功。與模型組比較，禹州漏蘆各劑量組能夠顯著性的抑制AST、ALT、MDA 含量的升高，增強(qiáng)GSH-Px、SOD 活性;結(jié)合肝臟組織病理學(xué)觀察，各組的生化指標(biāo)的數(shù)值與病理切片結(jié)果相符，均可顯示禹州漏蘆醇提物能夠減輕肝細(xì)胞變性、炎癥浸潤及壞死的病變，并促進(jìn)肝細(xì)胞的再生及修復(fù)，抑制肝損傷敏感酶的升高，提高機(jī)體清除氧自由基能力并抑制肝損傷。實(shí)驗(yàn)證明:禹州漏蘆藥材具有保護(hù)CCl4所致小鼠急性肝損傷的作用及其保肝作用與其清除氧自由基，抗脂質(zhì)過氧化損傷密切相關(guān)。對于禹州漏蘆藥材的保肝活性部位、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其他作用機(jī)制，有待以后進(jìn)一步研究。

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