新疆塔城地區(qū)綿羊細(xì)粒棘球蚴流行株基因分型研究

宋雪梅，程子兵，王輝勝，劉田莉，喬 軍，孟慶玲＊，張金生，陳創(chuàng)夫

（1.石河子大學(xué) 動 物科技學(xué)院，新疆 石 河子832003；2.新疆塔城地區(qū)動物疾控與診斷中心，新疆 塔 城834700；3.新疆沙灣縣烏蘭烏蘇鎮(zhèn)獸醫(yī)站，新疆 沙 灣，832100）

細(xì)粒棘球蚴病是由細(xì)粒棘球絳蟲（Echinococcus granuloses，Eg）的中絳期幼蟲-棘球蚴（Echinococcus）寄生在宿主體內(nèi)所致的一種嚴(yán)重的人畜共患性疾病［1-2］。該病主要在以畜牧業(yè)為主的國家或地區(qū)流行，細(xì)粒棘球絳蟲存在著大量內(nèi)部變異的蟲株，基因的多樣性導(dǎo)致其對不同類型的宿主的感染性不同，在不同的地理環(huán)境中，其傳播動力學(xué)、致病性、抗原反應(yīng)等也不同，從而影響疫苗及診斷試劑的研制［7-8］。所以，從遺傳學(xué)角度研究其種群結(jié)構(gòu)有重大意義。利用分子生物學(xué)技術(shù)可了解細(xì)粒棘球絳蟲基因組成及結(jié)構(gòu)上的差異，為蟲種及不同地理株的鑒定提供依據(jù)，而線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶亞單位1（Cytochrome c oxidase subunit 1，CO1）是線粒體基因組中進(jìn)化速率較慢且無重組，常作為物種遺傳多樣性、遺傳分化、起源進(jìn)化研究的最適遺傳標(biāo)記，被研究者們廣泛采用。近年來，許多學(xué)者以細(xì)粒棘球絳蟲基因組特征作為鑒別的依據(jù)，將其分為10種不同的基因型（G1～G10）［9-11］。為了弄清新疆塔城地區(qū)綿羊細(xì)粒棘球蚴流行株基因型，本研究選擇了序列短易于擴(kuò)增的線粒體DNA 12S r RNA基因?qū)π陆堑貐^(qū)的細(xì)粒棘球蚴進(jìn)行PCR檢測鑒定，再對CO1基因進(jìn)行序列測定和分析，研究塔城地區(qū)綿羊細(xì)粒棘球蚴流行株基因型，將為該地區(qū)綿羊細(xì)粒棘球蚴病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

組織DNA提取試劑盒、Taq plus DNA聚合酶、d NTP、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、瓊脂糖、DNA Marker及其他生化試劑購自上海生物工程公司。p MD18-T Vector載體購自大連Ta Kara公司。宿主菌E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 病料的采集及DNA的提取

從新疆塔城地區(qū)各縣屠宰場收集感染細(xì)粒棘球蚴綿羊的肝臟，以一個(gè)包囊為一個(gè)包蟲病灶，共分離到61個(gè)包蟲包囊，抽取囊液于1.5 m L的EP管中，12 000 rpm／m離心10 min，將上清液置于-20℃保存，將有原頭蚴的樣品用TIANamp Genomic DNA Kit提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank中已公布的細(xì)粒棘球蚴線粒體DNA 12S r RNA（FR666874）基因序列和CO1基因序列（GU951512），應(yīng)用primer 5.0分別設(shè)計(jì)其上、下游引物，引物合成及測序服務(wù)由北京華大生物工程有限公司完成。12S rRNA基因引物：P1：5′-GTATTTTGTAAAGTTGTTCTA-3′；P2：5′-CTAAATCACAT-CATCTTACAAT-3′。CO1 基 因 引 物：P3：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′。P4：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′。

1.4 感染細(xì)粒棘球蚴的綿羊肝臟PCR檢測

以提取的基因組DNA為模板，加特異性12S r RNA引物，擴(kuò)增細(xì)粒棘球蚴12S r RNA基因片段。采用50μL反應(yīng)體系：DNA模板4μL，10×PCR buffer 5μL，引物 P1（25 pmol／μL）、P2（25 pmol／μL）各1μL，2.5 mmol／L d NTP 4μL，水34.7μL，Taq DNA聚合酶0.3μL（5 U／μL）混勻。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，57℃退火1 min，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.5 CO1基因的PCR擴(kuò)增與克隆

將12S rRNA基因檢測陽性樣品再進(jìn)行CO 1基因擴(kuò)增測序。以12S rRNA基因檢測陽性樣品的基因組DNA為模板，加特異性CO1引物，擴(kuò)增細(xì)粒棘球蚴CO1基因片段。PCR反應(yīng)采用50 u L反應(yīng)體系：DNA模板4μL，10×PCR buffer 5μL，引物P3（25 pmol／μL）、P4（25 pmol／μL）各1μL，2.5 mmol／L d NTP 4μL，水34.7μL，Taq DNA聚合酶0.3μL（5 U／μL）混勻。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 S，45℃退火50 S，72℃延伸50 S，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。用上海生工生產(chǎn)的DNA gel Extraction Kit回收擴(kuò)增的CO1基因目的DNA片段。將回收片段與p MD18-T Vector載體于4℃過夜連接，次日轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，挑取單菌落，用菌液PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

1.6 測序與基因分型分析

將鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子送北京華大生物工程有限公司測序，用DNAMAN軟件對所測塔城地區(qū)細(xì)粒棘球蚴CO1基因序列進(jìn)行同源性分析，以GenBank中細(xì)粒棘球絳蟲的CO1基因序列AF297617（G1）［11］、FJ796205（G1） 、M84662（G2）、M84663（G3）、FJ796207（G6）［12］作為標(biāo)準(zhǔn)序列（表1），統(tǒng)計(jì)綿羊細(xì)粒棘球蚴CO1基因序列變異位點(diǎn)，確定在塔城地區(qū)流行的細(xì)粒棘球蚴CO1基因的基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的分離結(jié)果

通過對分離得到的61個(gè)細(xì)粒棘球蚴的包蟲病灶離心發(fā)現(xiàn)58份樣品中有原頭蚴，3份樣無原頭蚴，對這3份樣品進(jìn)行顯微鏡觀察，同樣未觀察到原頭蚴，確定這3個(gè)包囊樣品為不育囊，不育囊占4.9%。

表1 細(xì)粒棘球蚴CO1基因序列的核苷酸變異位點(diǎn)Table 1 Substition in the CO1 gene for the Echinococcus granulosus G1 genotype

2.2 細(xì)粒棘球蚴12S rRNA基因的PCR檢測結(jié)果

以分離得到的58個(gè)細(xì)粒棘球蚴基因組DNA為模板，利用特異性引物對12S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到了大小與預(yù)期值254 bp相符的目的條帶（圖1），且條帶清晰，說明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可信。且檢測發(fā)現(xiàn)58個(gè)樣品均為陽性擴(kuò)增。

圖1 細(xì)粒棘球蚴12S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of Echinococcus granulosus 12S rRNA gene M.Marker DL-2000；1-7.細(xì)粒棘球蚴12S rRNA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；1-7.PCR products of Echinococcus granulosus 12S r RNA gene

2.3 細(xì)粒棘球蚴CO1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用特異性引物對陽性樣品CO1基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到了大小與預(yù)期值444 bp相符的目的條帶（圖2），且條帶清晰，說明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可信。同時(shí)檢測發(fā)現(xiàn)58個(gè)樣品均為陽性擴(kuò)增。連接、轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落，通過PCR成功篩選到了陽性轉(zhuǎn)化子（圖3）。

2.4 細(xì)粒棘球蚴CO1基因的序列比對分析

圖2 細(xì)粒棘球蚴CO1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果M.Marker DL-2000；1-7.細(xì)粒棘球蚴CO1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Amplification of Echinococcus granulosus CO1 gene 1-7.PCRproducts of Echinococcus granulosus CO1 gene

圖3 細(xì)粒棘球蚴CO1基因重組菌液PCR的鑒定結(jié)果M.Marker DL-2000；1，3-10.細(xì)粒棘球蚴CO1基因菌液PCR陽性鑒定結(jié)果，2為陰性Fig.3 Amplification of Echinococcus granulosus CO1 gene recombinant bacteria1，3-10.PCR positive for Echinococcus granulosus CO1 gene recombinant bacteria，2 is negative

經(jīng)測序，塔城地區(qū)細(xì)粒棘球蚴線粒體DNA CO1基因片段長度為444 bp。對58個(gè)綿羊細(xì)粒棘球蚴流行株的CO1基因序列分析發(fā)現(xiàn)，新疆塔城地區(qū)綿羊細(xì)粒棘球蚴流行株基因型均為G1型。序列進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)（圖4），18個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，約占分析位點(diǎn)總數(shù)的4%，堿基的變異為轉(zhuǎn)換、顛換和缺失，未見有插入。核苷酸變異位點(diǎn)見表2。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)有14種不同的基因單倍體，XJ1占8.6%、XJ2占6.8%、XJ3占6.8%、XJ4占36.2%、XJ5占5.1%、XJ6占1.7%、XJ7占1.7%、XJ8占5.1%、XJ9占13.8%、XJ10占1.7%、XJ11占5.1%、XJ12占1.7%、XJ13占3.4%、XJ14占5.1%。

表2 新疆塔城細(xì)粒棘球蚴G1型各分離株CO1基因核苷酸變異位點(diǎn)Table 2 Substition in the CO1 gene for the Echinococcus granulosus G1 genotype investigated in Tacheng Xinjiang

3 討 論

細(xì)粒棘球絳蟲具有廣泛的中間宿主適應(yīng)性，在不同的地理生態(tài)環(huán)境和宿主種群中，存在不同的細(xì)粒棘球絳蟲蟲株［12-14］。在土耳其，發(fā)現(xiàn)G1型基因在綿羊體內(nèi)廣泛存在，且存在基因多態(tài)性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)G 3型基因均存在于綿羊和駱駝體內(nèi)［15］。在對歐洲四個(gè)不同國家棘球絳蟲遺傳變異的研究中，共檢測到G1、G2、G3和G4四種基因型，31個(gè)基因單倍體，其中7個(gè)不同的基因單倍體來自意大利［16］。G3基因型最早發(fā)現(xiàn)于印第安水牛體內(nèi)，此后，有研究發(fā)現(xiàn)G3基因型在綿羊、山羊、駱駝、人等中間宿主均有感染。在肯尼亞和利比亞，G1和G6兩種不同的基因型在駱駝群中流行，而在伊朗，G1、G3和G6三中不同的基因型在駱駝體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)［12］。在北非國家，G1和G6基因型共存，G1、G2、G5、G6和G7存在于阿根廷，G1、G4和G6型存在于吉爾吉斯，在這些地區(qū)的同一宿主體內(nèi)存在不同基因型的協(xié)同感染［17］。在青藏高原地區(qū)，發(fā)現(xiàn)G1型基因?yàn)橹饕餍兄?，共檢測到28個(gè)基因單倍體，也發(fā)現(xiàn)了G3型基因感染人群［18］。由于新疆地區(qū)存在適合細(xì)粒棘球絳蟲寄生的多種中間宿主，同時(shí)存在細(xì)粒棘球絳蟲發(fā)生變異的多種因素，故細(xì)粒棘球絳蟲可能發(fā)生變異，存在新的基因型或變異株。

養(yǎng)羊業(yè)是新疆塔城地區(qū)畜牧業(yè)的主要經(jīng)濟(jì)支柱，綿羊養(yǎng)殖量較大，且以放牧為主，該地區(qū)是人畜包蟲病的高發(fā)區(qū)。然而，到目前為止，尚不清楚該地區(qū)細(xì)粒棘球蚴流行株的遺傳背景。本研究共檢測了采自塔城地區(qū)各屠宰場綿羊的58個(gè)細(xì)粒棘球蚴包囊分離株，通過對CO1基因序列測定及分析，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)綿羊感染細(xì)粒棘球蚴的基因型均為G1型，且存在18個(gè)不同的核苷酸變異位點(diǎn)，約占分析位點(diǎn)總數(shù)的4%。堿基的變化包括轉(zhuǎn)換、顛換和缺失，未見有插入。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)有14種不同的基因單倍體，且發(fā)現(xiàn)同一宿主的分離株基因序列變異位點(diǎn)不同，存在不同的G1基因單倍體，分析其原因，可能是由于綿羊在采食過程中食入了不同基因型的蟲卵而感染引起的。本研究同時(shí)證實(shí)新疆塔城地區(qū)綿羊細(xì)粒棘球蚴具有較豐富的遺傳多態(tài)性及遺傳差異，這為該地區(qū)綿羊包蟲病分子流行病學(xué)調(diào)查和防控工作提供了科學(xué)依據(jù)，對掌握細(xì)粒棘球絳蟲的分子生物學(xué)特征、尋找和追蹤傳染源、確定棘球絳蟲的致病性、指導(dǎo)包蟲的疫苗研制和臨床治療、制定科學(xué)有效的防控措施具有重要意義。

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