大圍山微型雞POU1F1基因編碼區(qū)的克隆及序列分析

富國文，王紹卿，滕曉紅，榮華，賈俊靜，樊月圓

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650201）

垂體特異轉(zhuǎn)錄因子（pituitary specific transcription 1，POU1F1）是動物垂體前葉特異表達的一種具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子表達的產(chǎn)物通過與垂體中PRL基因、GH基因、TSH基因以及POU 1F1自身的調(diào)控元件結(jié)合，調(diào)控這些基因的轉(zhuǎn)錄，從而對動物的生長發(fā)育等起著重要的調(diào)控作用［1-2］。POU1F1由POU1F1基因編碼，是POU結(jié)構(gòu)域因子家族的一員。POU家族中成員大多具有一個POU特異區(qū)（POU-HD）和一個POU同源區(qū)（POU-SD）的DNA結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域能識別特異的基因序列并與之結(jié)合。從而引起細胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄，促進垂體前葉促生長素細胞、催乳細胞和促甲狀腺素細胞基因的轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)活性［3］。在人上，POU1F1基因位點的突變可導(dǎo)致人類的生長發(fā)育異常，包括生長緩慢及矮小等癥狀。同時GH、PRL和TSH-β缺乏的程度依賴于POU1F1基因的突變類型；在鼠上，已研究證實該基因與矮小性狀基因座存在緊密連鎖關(guān)系［4-7］。在家禽上，POU1F1基因位點的突變與其生長性能相關(guān)性也被做了大量的研究［8-10］。

大圍山微型雞是云南省的優(yōu)良地方品種，主要分布在云南省紅河州屏邊苗族自治縣境內(nèi)大圍山自然保護區(qū)。該雞種具有較高的屠宰率和全凈膛率，產(chǎn)蛋率高，耗料少，飼料報酬率高等優(yōu)點。但是它個體小，成為其在生產(chǎn)上的致命缺點。如果能從分子水平上找出該品種體型較小的成因，無疑對改變其生長狀況具有重要實際意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

來自云南武定縣的武定雞和大圍山的微型雞各5只。從翅下采血5 m L，于-80℃保存。

1.2 基因組DNA制備

血樣基因組DNA的提取用常規(guī)的酚-氯仿抽提法，提取后的DNA用TE緩沖液溶解后，經(jīng)0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計測定濃度后，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增

引物設(shè)計：參照GeneBank中提供的雞POU1F1基因的序列（登錄號：NC＿006088），利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物。引物共6對，包括6個完整的外顯子區(qū)域，引物的合成及測序工作由華大基因技術(shù)有限公司完成。引物信息如下（表1）。

表1 引物序列、產(chǎn)物大小、位置以及Tm值Table 1 The sequences of primers，length，location and Tm of each PCR product

15μL PCR反應(yīng)體系：10×Buffer（含15 m M Mg2＋）1.5μL，2 m M d NTPs 1.5μL，2 U／μL Taq DNA聚合酶0.25μL，5 M混合引物（上游引物和下游引物各為10 pmol／μL）0.6μL，模板DNA （50 ng／μL）1.0μL，dd H2O 10.15μL。

PCR擴增程序：94℃預(yù)變性4min；35個循環(huán)（94℃30s，Tm 30 s，72℃30 s）；72℃延伸10min，4℃保存。

1.4 POU1F1基因PCR產(chǎn)物的回收與測序

PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其擴增結(jié)果，并送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，使用軟件剪切拼接后獲得編碼區(qū)序列。

1.5 POU1F1基因編碼區(qū)序列的生物信息學(xué)分析

圖1 POU1F1基因P1～P6引物的擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of P1～P6 primers for POU1F1 geneM.DNA標準 DL2000；1，2.P1引物的擴增產(chǎn)物；3，4.P2引物的擴增產(chǎn)物；5，6.P3引物的擴增產(chǎn)物；7，8.P4引物的擴增產(chǎn)物；9，10.P5引物的擴增產(chǎn)物；11，12.P6引物的擴增產(chǎn)物M.DNA Marker DL2000；1，2.Product of P1；3，4.Product of P2；5，6.Product of P3；7，8.Product of P4；9，10.Product of P5；11，12.Product of P6

利用DNAstar軟件包中的EditSeq、GeneQuest和Meg Align對PUO1F1基因序列、ORF進行分析；利用Protean軟件對POU1F1基因編碼產(chǎn)物的氨基酸組成、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其理化性質(zhì)進行分析預(yù)測；從NCBI下載不同物種的POU1F1基因序列，利用DNAman和DNAstar軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹及遺傳距離研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 POU1F1基因的PCR擴增結(jié)果

POU1F1基因各引物均得到特異性擴增，如圖1所示。其中P1引物的擴增產(chǎn)物為1和2號樣品，擴增片段大小為245 bp；P2引物的擴增產(chǎn)物為3和4號樣品，擴增片段大小為286 bp；P3引物的擴增產(chǎn)物為5和6號樣品，擴增片段大小為318 bp；P4引物的擴增產(chǎn)物為7和8號樣品，擴增片段大小為269 bp；P5引物的擴增產(chǎn)物為9和10號樣品，擴增片段大小為208 bp；P6引物的擴增產(chǎn)物為11和12號樣品，擴增片段大小為245 bp。

2.2 大圍山微型雞編碼區(qū)的序列分析

利用DNAstar軟件對6對引物的測序結(jié)果與Gallus gallus（NM＿204319）進行了比對，手工剪接后得到了全長編碼區(qū)序列，大圍山微型雞POU1F1基因編碼區(qū)序列全長為984 bp，武定雞POU1F1基因編碼區(qū)序列全長也為984 bp。與Gallus gallus（NM＿204319）進行了比較，在檢測的個體中，大圍山微型雞在編碼區(qū)的836 bp處發(fā)生了一個C／T的單堿基突變，該突變未引起279位Ile變異。利用EditSeq和GeneQuest軟件，對大圍山微型雞POU1F1基因的編碼區(qū)的核苷酸組成進行分析，其中核苷酸A、C、G和T分別為287、238、229和230個。

2.3 POU1F1基因的開放閱讀框分析

本研究將大圍山微型雞編碼區(qū)序列通過Edit-Seq軟件進行分析，獲得了一條長456 bp的ORF（圖2），該ORF起始密碼子位于±1，終止密碼子位于±984，推測大圍山微型雞POU1F1基因可編碼1個由327個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。

圖2 大圍山微型雞POU1F1基因ORF序列及其編碼氨基酸序列Fig.2 The ORF sequence and encoded amino acid sequence of POU1F1 gene of Daweishan mini chickens

2.4 POU1F1基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)分析

用Bioedit及Protean軟件對POU1F1基因編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)進行預(yù)測，結(jié)果顯示，POU1F1基因編碼327個氨基酸，其中絲氨酸（Ser）和亮氨酸（Leu）所占比例最高，分別達到了12.23%和9.17%（圖3）；推測該編碼產(chǎn)物在p H 7.0環(huán)境下的電荷量為9.81，理論等電點為 8.67，理論分子質(zhì)量為38801.19 Da.

根據(jù)Protean結(jié)果，POU1F1基因的編碼產(chǎn)物的疏水性在多肽鏈第12位纈氨酸具有最低的分值（-2.14），在第250位的精氨酸具有最高的分值（3.72），且推斷整條多肽鏈氨基酸序列表現(xiàn)為親水性而沒有明顯的疏水性區(qū)域。

2.5 大圍山微型雞與其他物種POU1F1基因核苷酸序列同源性分析

將NCBI上不同物種的POU1F1基因核苷酸序列（牛：NM＿174579，家犬：XM＿005638736，山羊：NM＿001285673，野鴿：XM＿005511429，原雞：NM＿204319，人：NM＿001122757，獼猴：NM＿001042860，家鼠：NM＿008849，綿羊：NM＿001009350，褐家鼠：NM＿013008，野豬：NM＿214163）與本研究所獲取的大圍山微型雞以及武定雞的POU1F1基因的核苷酸序列進行對比，利用Meg Align軟件分析了這13條核苷酸序列的同源性（表2）并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。結(jié)果表明，原雞、武定雞以及大圍山微型雞與其它10個物種POU1F1基因的核苷酸相似性從23.6～26.9，親緣關(guān)系較遠。

圖3 大圍山微型雞POU1F1基因編碼區(qū)序列的氨基酸組成Fig.3 Amino acid composition of coding DNA sequences of POU1F1 gene of Daweishan mini chickens

表2 不同物種POU1F1基因的遺傳距離Table 2 The sequence distance base on the POU1F1 gene of different species

3 討 論

1992年，在家禽中，火雞的POU1F1基因首先被Wong等所克隆?？寺〗Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，火雞的POU1F1基因與哺乳動物類似，存在三種POU1F1m RNA，分別為t POU1F1＊，t POU1F1β＊ 和t POU1F1w＊［11］；Kurima等［12］1998 年 研 究發(fā)現(xiàn)，三種POU1F1 m RNA中t POU1F1＊表達量最高，t POU1F1β＊表達量最低。Tanaka等［13］1999年從雞的垂體中克隆了編碼325和327氨基酸的兩種POU1F1m RNA，分別為c POU1F1α和c POU1F1γ。研究表明，POU1F1基因的正常表達是垂體前葉正常發(fā)育及激素正常分泌的必要條件。POU1F1基因突變可能造成人和鼠復(fù)合性垂體激素缺乏癥。姜潤澤［14］研究表明，POU 1 F 1基因第六外顯子處（299Asn→Ile）的突變與雞（尤其是公雞）早期生長速度顯著相關(guān)（P＜0.05）；邱峰芳等［15］研究表明，POU1F1基因與雞的1～7周齡體重極顯著相關(guān)（P＜0.01），與8周齡體重顯著相關(guān)（P＜0.05）；陶勇等［16］在POU1F1基因型檢測到一個 A→T突變，雜合型個體體重顯著高于純合型個體。

圖4 不同物種POU1F1基因系統(tǒng)進化樹Fig.4 The phylogentic tree base on the POU1F1 gene of different species

本研究通過對云南地方品種-大圍山微型雞的POU1F1基因6個克隆片段進行拼接后得到了大圍山微型雞POU1F1基因編碼區(qū)序列，該序列為包括終止密碼子在內(nèi)的完整的編碼區(qū)序列，序列長度為984 bp，編碼有327個氨基酸殘基。朱志明等［17］對半番鴨的POU1F1基因進行克隆，獲得了完整的cDNA序列，全長為2 209 bp，與雞的氨基酸序列同源性達到了96.3%。本研究對牛、家犬、山羊、野鴿、原雞、人、獼猴、家鼠、綿羊、褐家鼠、野豬、大圍山微型雞和武定雞的核苷酸序列比對發(fā)現(xiàn)，家禽與哺乳動物有較遠的親緣關(guān)系，核苷酸相似性從23.6～26.9，這與家禽POU1F1序列的特殊性有關(guān)。對于家禽而言，禽類POU1F1存在一個由38個氨基酸組成的肽段，該肽段是禽類所特有的，位于相當于哺乳動物外顯子2、3之間，將其命名為外顯子2a。從遺傳距離分析及基因系統(tǒng)進化樹，我們也發(fā)現(xiàn)，親緣關(guān)系較近先聚在一起，如：牛、山羊及綿羊最先聚在一起，核苷酸相似性達到97.6%以上，聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)基本相符。同時在原雞、武定雞以及大圍山微型雞的POU1F1基因編碼區(qū)序列比對中，在大圍山微型雞的836bp處發(fā)生了一個C／T的單堿基突變，雖然在核苷酸水平上有一些差異，但屬于同義突變，并不影響編碼蛋白的結(jié)構(gòu)組成。

本研究所獲得的大圍山微型雞的完整的POU1F1編碼區(qū)序列，為以后研究POU1F1基因與大圍山微型雞經(jīng)濟性狀的關(guān)聯(lián)分析提供了基礎(chǔ)，也為研究大圍山微型雞體型矮小的分子機理奠定了基礎(chǔ)，下一步研究將在增大樣本量后，從多個角度全面地揭示其遺傳特性。

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