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    IL-11對(duì)ITP患者Th1、Th2細(xì)胞及T-bet、GATA-3 mRNA的影響

    2014-01-05 08:18:36姚榮欣李欠欠林穎周謝敏包云華
    關(guān)鍵詞:極化比值細(xì)胞因子

    姚榮欣,李欠欠,林穎,周謝敏,包云華

    (1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 血液科,浙江 溫州 325027;2.耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理科,New Haven,Connecticut,06520)

    細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-11(IL-11)由人類骨髓基質(zhì)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生,近年來(lái),國(guó)內(nèi)外有報(bào)道使用IL-11治療免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)取得了較好的效果[1-6],但其機(jī)制不明。本研究觀察ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)在體外加入IL-11培養(yǎng)后Th1、Th2細(xì)胞比例及T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的改變,探討IL-11治療ITP的作用機(jī)制。

    1 對(duì)象和方法

    1.1 研究對(duì)象 選取2011年6月-2012年8月在本院住院的ITP患者10例,均符合下列條件:首次發(fā)病者院外未應(yīng)用過(guò)丙種球蛋白、糖皮質(zhì)激素;ITP復(fù)發(fā)者近半年未應(yīng)用糖皮質(zhì)激素;近4周無(wú)感染及其他急慢性疾??;無(wú)過(guò)敏和免疫性疾病史及家族史。其中男4例,女6例,平均年齡(32.8±9.4)歲。

    1.2 試劑與儀器 IL-11(巨和粒)購(gòu)自山東齊魯制藥廠;CD3 PerCP、IL-4 PE、IFN-γAPC、CD8 FITC、IGG1 PE、IGG1 APC、CD69 PE(BD Biosciences,美國(guó));BFA、PMA、離子霉素(Sigma,美國(guó));人淋巴細(xì)胞分離液(TBD,天津);胎牛血清(四季青,杭州);RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco,美國(guó));Trizol(Invitrogen,美國(guó));MBI RT試劑盒(Fermentas,加拿大);Roche SYBR Green I染料(Roche,瑞士);BD FACS Canto II流式細(xì)胞儀(BD Biosciences,美國(guó));Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀(Roche,瑞士);酶標(biāo)儀(Tecan,瑞士)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 PBMC分離:無(wú)菌抽取每例ITP患者外周靜脈血10 mL,肝素抗凝,用PBS液1:1稀釋后,用密度梯度離心法分離PBMC,錐蟲藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞活率大于95%。

    1.3.2 加IL-11后細(xì)胞培養(yǎng):PBMC用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度(分別加入100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素+100 U/mL IL-2)至6×107個(gè)細(xì)胞/mL,各取1 mL分裝于6孔板內(nèi)中,編號(hào)1、2、3、4、5,分別加入IL-11 0、25、50、100及200 ng。放入37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱內(nèi),培養(yǎng)4 d,錐蟲藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞活率大于95%。

    1.3.3 Th1、Th2細(xì)胞測(cè)定:將培養(yǎng)4 d后每孔細(xì)胞懸液分別取培養(yǎng)液200 L,用流式細(xì)胞儀測(cè)CD4+T細(xì)胞Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞比例。采用CD3與CD8反射門選取CD4+T細(xì)胞,即以CD3+CD8-IFN-γ+(APC標(biāo)記IFN-γ)標(biāo)記Th1,以CD3+CD8-IL-4+(PE標(biāo)記IL-4)標(biāo)記Th2,因Th1、Th2分群不明顯,應(yīng)用CD3+CD8-IFN-γ-及CD3+CD8-IL-4-作為陰性對(duì)照,設(shè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)小于0.1%作為陰性閾值,在陰性閾值基線基礎(chǔ)上計(jì)數(shù)CD3+CD8-IFN-γ+細(xì)胞及CD3+CD8-IL-4+細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞群中Th1、Th2細(xì)胞所占百分比,并計(jì)算Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞比值(Th1/Th2)。

    1.3.4 T-bet mRNA、GATA-3 mRNA檢測(cè):培養(yǎng)4 d后每孔細(xì)胞懸液取1×106,采用Trizol試劑提取總RNA,采用Tecan酶標(biāo)儀測(cè)量其濃度和純度,用瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。取總RNA 1μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Green I染料檢測(cè)T-bet mRNA、GATA-3 mRNA表達(dá)情況。引物序列見(jiàn)表1,以GAPDH作為內(nèi)參基因,每個(gè)標(biāo)本分別進(jìn)行T-bet、GATA-3、GAPDH的檢測(cè)。反應(yīng)條件:熱啟動(dòng)95 ℃ 5 min;擴(kuò)增(95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,60 ℃采集熒光信號(hào)一次)連續(xù)45個(gè)循環(huán);熔解95 ℃ 15 s,65 ℃15 s,升溫到95 ℃的同時(shí)連續(xù)檢測(cè)熒光信號(hào)。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)設(shè)3個(gè)副孔。所有的PCR產(chǎn)物均經(jīng)熔解曲線分析以分辨目的產(chǎn)物與非特異產(chǎn)物以及引物二聚體。質(zhì)控:加一個(gè)空白管,用雙蒸水替代cDNA。以Target/Ref進(jìn)行相對(duì)定量,即分別以T-bet/GAPDH和GATA-3/GAPDH表示T-bet mRNA、GATA-3 mRNA表達(dá)量。并計(jì)算T-bet mRNA與GATA-3 mRNA的比值。

    表1 引物序列

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件作數(shù)據(jù)處理。檢測(cè)指標(biāo)以 ±s描述,多組間均數(shù)比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CD4+T細(xì)胞Th1、Th2流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果 ITP患者PBMC加入不同濃度的IL-11培養(yǎng)后,對(duì)各組間Th1、Th2比例及Th1/Th2分別進(jìn)行單因素方差分析(方差齊性檢驗(yàn)P>0.1),結(jié)果顯示P均小于0.05,說(shuō)明不同濃度IL-11對(duì)Th1、Th2比例及Th1/Th2比值的影響作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    當(dāng)IL-11濃度為100 ng/mL時(shí),與濃度為0的對(duì)照組比較差異最大,表現(xiàn)為Th1比例及Th1/Th2比值下降,Th2比例升高(均P<0.01)。具體數(shù)值見(jiàn)表2。

    表2 各組Th1、Th2及Th1/Th2測(cè)定結(jié)果(n=10, ±s)

    2.2 T-bet mRNA、GATA-3 mRNA RT-PCR測(cè)定結(jié)果

    提取mRNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳檢查,瓊脂凝膠電泳分析條帶明亮,無(wú)雜帶,說(shuō)明基因完整。目的基因T-bet mRNA、Gata-3 mRNA及內(nèi)參基因GAPDH mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后可見(jiàn)3個(gè)副孔重復(fù)性好,曲線上升期明顯,拐點(diǎn)清楚,基線平,可見(jiàn)平臺(tái)期,表明擴(kuò)增良好。擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線均為單峰,說(shuō)明引物良好,提取的mRNA完整。

    對(duì)各濃度組間T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3分別進(jìn)行單因素方差分析(方差齊性檢驗(yàn)P>0.1),結(jié)果顯示P均小于0.05,說(shuō)明不同濃度IL-11對(duì)T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3的影響作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    當(dāng)IL-11濃度為100 ng/mL時(shí),與濃度為0的對(duì)照組相比,T-bet mRNA表達(dá)下降,GATA-3 mRNA表達(dá)增加,T-bet/GATA-3比值顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。具體數(shù)值見(jiàn)表3。

    表3 各組T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3檢測(cè)結(jié)果(n=10, ±s)

    3 討論

    IL-11主要由間充質(zhì)來(lái)源的黏附細(xì)胞產(chǎn)生,具有多種生物活性,在免疫調(diào)節(jié)、造血調(diào)控方面具有重要作用。目前的研究認(rèn)為IL-11能促進(jìn)Th1細(xì)胞向Th2亞群分化[7-10]。

    CD4+的T細(xì)胞在抗原的刺激下,分化為中間狀態(tài)的Th0細(xì)胞,進(jìn)而在不同的微環(huán)境條件下,分化為Thl和Th2類細(xì)胞。由于Th1、Th2細(xì)胞缺乏特異的細(xì)胞表面抗原標(biāo)記,目前一般通過(guò)檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4水平來(lái)作為其各自的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀以CD3、CD8反射門選取CD4+T細(xì)胞,Thl細(xì)胞應(yīng)用IFN-γ APC熒光抗體標(biāo)記,Th2細(xì)胞應(yīng)用IL-4 PE熒光抗體標(biāo)記,通過(guò)測(cè)定CD4+T細(xì)胞中IFN-γ、IL-4來(lái)確定Thl、Th2細(xì)胞百分率。

    在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)ITP患者PBMC在加入IL-11培養(yǎng)后,Th1細(xì)胞比例下降,Th2細(xì)胞比例升高,Th1/Th2比值下降,這種現(xiàn)象在IL-11濃度為100 ng/mL時(shí)最為明顯,表明IL-11在體外培養(yǎng)條件下能促使ITP患者PBMC由Th1細(xì)胞極化向Th2細(xì)胞極化漂移。作為自身免疫性疾病,成人慢性ITP具有特異表達(dá)Th1極化以及Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平升高現(xiàn)象[11-12]。現(xiàn)有研究表明CD4+T細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞亞群比例失衡是ITP發(fā)病的機(jī)制之一[13-17],由此我們推測(cè),通過(guò)促使CD4+T細(xì)胞更多地由Th1細(xì)胞極化向Th2細(xì)胞極化漂移,從而糾正ITP患者體內(nèi)存在的免疫失衡可能是IL-11在臨床上有效治療ITP的機(jī)制之一。

    T-bet和GATA-3是調(diào)節(jié)Th1和Th2類細(xì)胞因子表達(dá)的兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[18-21]。T-bet是轉(zhuǎn)錄因子T-box家族成員之一,表達(dá)于包括骨髓、臍血祖細(xì)胞及干細(xì)胞在內(nèi)的血細(xì)胞,主要為CD4+T細(xì)胞。T-et通過(guò)激活I(lǐng)FN-γ基因而發(fā)揮其對(duì)Th1細(xì)胞發(fā)育的正性調(diào)控作用,其高表達(dá)與Th1型細(xì)胞因子細(xì)胞的升高相符合。將T-bet基因反轉(zhuǎn)錄于成熟的Th2細(xì)胞能促使其轉(zhuǎn)化為分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞,并同時(shí)抑制IL-4、IL-5等細(xì)胞因子的表達(dá),因此,T-bet在促使Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞極化的同時(shí)明顯抑制了Th2細(xì)胞的極化[22]。T-bet的表達(dá)在Th1細(xì)胞發(fā)展的早期階段明顯增高,但是在Th2細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中并不表達(dá)。GATA-3是鋅指蛋白GATA家族的成員之一,在促進(jìn)Th2細(xì)胞形成和抑制Th1細(xì)胞形成過(guò)程中起核心作用。CD4+T細(xì)胞僅表達(dá)低水平的GATA-3,當(dāng)CD4+T細(xì)胞向Th2分化時(shí)該表達(dá)上調(diào),而當(dāng)CD4+T細(xì)胞向Thl分化時(shí)該表達(dá)下調(diào),在成熟Thl細(xì)胞中則不能被測(cè)到,故GATA-3僅特異表達(dá)于Th2細(xì)胞。此外,GATA-3既可抑制Thl細(xì)胞分化,亦可促使其向Th2細(xì)胞的極化方向發(fā)生改變,GATA-3在促使Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞極化的同時(shí)抑制了Thl細(xì)胞的極化[23]。在自身免疫性疾病和移植物抗宿主病中,可以觀察到T-bet上升和GATA-3下降現(xiàn)象[24-25]。

    Chakir等[26]發(fā)現(xiàn),在多種產(chǎn)生Th1樣和Th2樣細(xì)胞因子的細(xì)胞中,T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的表達(dá)上調(diào),并且可以比較容易地從混合細(xì)胞群中提取總RNA,通過(guò)RT-PCR的方法測(cè)定,這提示T-bet/GATA-3可以在許多種情況下反映Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡狀況。

    我們采用RT-PCR技術(shù),從轉(zhuǎn)錄水平上測(cè)定Th1、Th2細(xì)胞的調(diào)控因子T-bet mRNA、GATA-3 mRNA的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)ITP患者的PBMC經(jīng)IL-11培養(yǎng)后,T-bet mRNA表達(dá)下降,而GATA-3 mRNA表達(dá)增強(qiáng),T-bet mRNA/GATA-3 mRNA比值下降。

    綜上所述,我們分別通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定Th1、Th2細(xì)胞比例及Th1/Th2比值和RT-PCR方法測(cè)定Th1、Th2細(xì)胞的調(diào)控基因T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的表達(dá),從不同的角度表明,IL-11在體外能促使ITP患者CD4+T細(xì)胞從Th1極化優(yōu)勢(shì)向Th2極化優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化,這種轉(zhuǎn)化可能是通過(guò)其調(diào)控基因T-bet mRNA和GATA-3 mRNA來(lái)控制的。這可能是IL-11有效治療ITP的機(jī)制之一。

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