• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    IL-11對(duì)ITP患者Th1、Th2細(xì)胞及T-bet、GATA-3 mRNA的影響

    2014-01-05 08:18:36姚榮欣李欠欠林穎周謝敏包云華
    關(guān)鍵詞:極化比值細(xì)胞因子

    姚榮欣,李欠欠,林穎,周謝敏,包云華

    (1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 血液科,浙江 溫州 325027;2.耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理科,New Haven,Connecticut,06520)

    細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-11(IL-11)由人類骨髓基質(zhì)細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生,近年來(lái),國(guó)內(nèi)外有報(bào)道使用IL-11治療免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)取得了較好的效果[1-6],但其機(jī)制不明。本研究觀察ITP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)在體外加入IL-11培養(yǎng)后Th1、Th2細(xì)胞比例及T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的改變,探討IL-11治療ITP的作用機(jī)制。

    1 對(duì)象和方法

    1.1 研究對(duì)象 選取2011年6月-2012年8月在本院住院的ITP患者10例,均符合下列條件:首次發(fā)病者院外未應(yīng)用過(guò)丙種球蛋白、糖皮質(zhì)激素;ITP復(fù)發(fā)者近半年未應(yīng)用糖皮質(zhì)激素;近4周無(wú)感染及其他急慢性疾??;無(wú)過(guò)敏和免疫性疾病史及家族史。其中男4例,女6例,平均年齡(32.8±9.4)歲。

    1.2 試劑與儀器 IL-11(巨和粒)購(gòu)自山東齊魯制藥廠;CD3 PerCP、IL-4 PE、IFN-γAPC、CD8 FITC、IGG1 PE、IGG1 APC、CD69 PE(BD Biosciences,美國(guó));BFA、PMA、離子霉素(Sigma,美國(guó));人淋巴細(xì)胞分離液(TBD,天津);胎牛血清(四季青,杭州);RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco,美國(guó));Trizol(Invitrogen,美國(guó));MBI RT試劑盒(Fermentas,加拿大);Roche SYBR Green I染料(Roche,瑞士);BD FACS Canto II流式細(xì)胞儀(BD Biosciences,美國(guó));Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀(Roche,瑞士);酶標(biāo)儀(Tecan,瑞士)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 PBMC分離:無(wú)菌抽取每例ITP患者外周靜脈血10 mL,肝素抗凝,用PBS液1:1稀釋后,用密度梯度離心法分離PBMC,錐蟲藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞活率大于95%。

    1.3.2 加IL-11后細(xì)胞培養(yǎng):PBMC用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度(分別加入100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素+100 U/mL IL-2)至6×107個(gè)細(xì)胞/mL,各取1 mL分裝于6孔板內(nèi)中,編號(hào)1、2、3、4、5,分別加入IL-11 0、25、50、100及200 ng。放入37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱內(nèi),培養(yǎng)4 d,錐蟲藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞活率大于95%。

    1.3.3 Th1、Th2細(xì)胞測(cè)定:將培養(yǎng)4 d后每孔細(xì)胞懸液分別取培養(yǎng)液200 L,用流式細(xì)胞儀測(cè)CD4+T細(xì)胞Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞比例。采用CD3與CD8反射門選取CD4+T細(xì)胞,即以CD3+CD8-IFN-γ+(APC標(biāo)記IFN-γ)標(biāo)記Th1,以CD3+CD8-IL-4+(PE標(biāo)記IL-4)標(biāo)記Th2,因Th1、Th2分群不明顯,應(yīng)用CD3+CD8-IFN-γ-及CD3+CD8-IL-4-作為陰性對(duì)照,設(shè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)小于0.1%作為陰性閾值,在陰性閾值基線基礎(chǔ)上計(jì)數(shù)CD3+CD8-IFN-γ+細(xì)胞及CD3+CD8-IL-4+細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞群中Th1、Th2細(xì)胞所占百分比,并計(jì)算Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞比值(Th1/Th2)。

    1.3.4 T-bet mRNA、GATA-3 mRNA檢測(cè):培養(yǎng)4 d后每孔細(xì)胞懸液取1×106,采用Trizol試劑提取總RNA,采用Tecan酶標(biāo)儀測(cè)量其濃度和純度,用瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。取總RNA 1μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用SYBR Green I染料檢測(cè)T-bet mRNA、GATA-3 mRNA表達(dá)情況。引物序列見(jiàn)表1,以GAPDH作為內(nèi)參基因,每個(gè)標(biāo)本分別進(jìn)行T-bet、GATA-3、GAPDH的檢測(cè)。反應(yīng)條件:熱啟動(dòng)95 ℃ 5 min;擴(kuò)增(95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,60 ℃采集熒光信號(hào)一次)連續(xù)45個(gè)循環(huán);熔解95 ℃ 15 s,65 ℃15 s,升溫到95 ℃的同時(shí)連續(xù)檢測(cè)熒光信號(hào)。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)設(shè)3個(gè)副孔。所有的PCR產(chǎn)物均經(jīng)熔解曲線分析以分辨目的產(chǎn)物與非特異產(chǎn)物以及引物二聚體。質(zhì)控:加一個(gè)空白管,用雙蒸水替代cDNA。以Target/Ref進(jìn)行相對(duì)定量,即分別以T-bet/GAPDH和GATA-3/GAPDH表示T-bet mRNA、GATA-3 mRNA表達(dá)量。并計(jì)算T-bet mRNA與GATA-3 mRNA的比值。

    表1 引物序列

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件作數(shù)據(jù)處理。檢測(cè)指標(biāo)以 ±s描述,多組間均數(shù)比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CD4+T細(xì)胞Th1、Th2流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果 ITP患者PBMC加入不同濃度的IL-11培養(yǎng)后,對(duì)各組間Th1、Th2比例及Th1/Th2分別進(jìn)行單因素方差分析(方差齊性檢驗(yàn)P>0.1),結(jié)果顯示P均小于0.05,說(shuō)明不同濃度IL-11對(duì)Th1、Th2比例及Th1/Th2比值的影響作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    當(dāng)IL-11濃度為100 ng/mL時(shí),與濃度為0的對(duì)照組比較差異最大,表現(xiàn)為Th1比例及Th1/Th2比值下降,Th2比例升高(均P<0.01)。具體數(shù)值見(jiàn)表2。

    表2 各組Th1、Th2及Th1/Th2測(cè)定結(jié)果(n=10, ±s)

    2.2 T-bet mRNA、GATA-3 mRNA RT-PCR測(cè)定結(jié)果

    提取mRNA反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳檢查,瓊脂凝膠電泳分析條帶明亮,無(wú)雜帶,說(shuō)明基因完整。目的基因T-bet mRNA、Gata-3 mRNA及內(nèi)參基因GAPDH mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后可見(jiàn)3個(gè)副孔重復(fù)性好,曲線上升期明顯,拐點(diǎn)清楚,基線平,可見(jiàn)平臺(tái)期,表明擴(kuò)增良好。擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線均為單峰,說(shuō)明引物良好,提取的mRNA完整。

    對(duì)各濃度組間T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3分別進(jìn)行單因素方差分析(方差齊性檢驗(yàn)P>0.1),結(jié)果顯示P均小于0.05,說(shuō)明不同濃度IL-11對(duì)T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3的影響作用差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    當(dāng)IL-11濃度為100 ng/mL時(shí),與濃度為0的對(duì)照組相比,T-bet mRNA表達(dá)下降,GATA-3 mRNA表達(dá)增加,T-bet/GATA-3比值顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。具體數(shù)值見(jiàn)表3。

    表3 各組T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、T-bet/GATA-3檢測(cè)結(jié)果(n=10, ±s)

    3 討論

    IL-11主要由間充質(zhì)來(lái)源的黏附細(xì)胞產(chǎn)生,具有多種生物活性,在免疫調(diào)節(jié)、造血調(diào)控方面具有重要作用。目前的研究認(rèn)為IL-11能促進(jìn)Th1細(xì)胞向Th2亞群分化[7-10]。

    CD4+的T細(xì)胞在抗原的刺激下,分化為中間狀態(tài)的Th0細(xì)胞,進(jìn)而在不同的微環(huán)境條件下,分化為Thl和Th2類細(xì)胞。由于Th1、Th2細(xì)胞缺乏特異的細(xì)胞表面抗原標(biāo)記,目前一般通過(guò)檢測(cè)Th1、Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4水平來(lái)作為其各自的表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀以CD3、CD8反射門選取CD4+T細(xì)胞,Thl細(xì)胞應(yīng)用IFN-γ APC熒光抗體標(biāo)記,Th2細(xì)胞應(yīng)用IL-4 PE熒光抗體標(biāo)記,通過(guò)測(cè)定CD4+T細(xì)胞中IFN-γ、IL-4來(lái)確定Thl、Th2細(xì)胞百分率。

    在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)ITP患者PBMC在加入IL-11培養(yǎng)后,Th1細(xì)胞比例下降,Th2細(xì)胞比例升高,Th1/Th2比值下降,這種現(xiàn)象在IL-11濃度為100 ng/mL時(shí)最為明顯,表明IL-11在體外培養(yǎng)條件下能促使ITP患者PBMC由Th1細(xì)胞極化向Th2細(xì)胞極化漂移。作為自身免疫性疾病,成人慢性ITP具有特異表達(dá)Th1極化以及Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平升高現(xiàn)象[11-12]。現(xiàn)有研究表明CD4+T細(xì)胞Th1/Th2細(xì)胞亞群比例失衡是ITP發(fā)病的機(jī)制之一[13-17],由此我們推測(cè),通過(guò)促使CD4+T細(xì)胞更多地由Th1細(xì)胞極化向Th2細(xì)胞極化漂移,從而糾正ITP患者體內(nèi)存在的免疫失衡可能是IL-11在臨床上有效治療ITP的機(jī)制之一。

    T-bet和GATA-3是調(diào)節(jié)Th1和Th2類細(xì)胞因子表達(dá)的兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[18-21]。T-bet是轉(zhuǎn)錄因子T-box家族成員之一,表達(dá)于包括骨髓、臍血祖細(xì)胞及干細(xì)胞在內(nèi)的血細(xì)胞,主要為CD4+T細(xì)胞。T-et通過(guò)激活I(lǐng)FN-γ基因而發(fā)揮其對(duì)Th1細(xì)胞發(fā)育的正性調(diào)控作用,其高表達(dá)與Th1型細(xì)胞因子細(xì)胞的升高相符合。將T-bet基因反轉(zhuǎn)錄于成熟的Th2細(xì)胞能促使其轉(zhuǎn)化為分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞,并同時(shí)抑制IL-4、IL-5等細(xì)胞因子的表達(dá),因此,T-bet在促使Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞極化的同時(shí)明顯抑制了Th2細(xì)胞的極化[22]。T-bet的表達(dá)在Th1細(xì)胞發(fā)展的早期階段明顯增高,但是在Th2細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中并不表達(dá)。GATA-3是鋅指蛋白GATA家族的成員之一,在促進(jìn)Th2細(xì)胞形成和抑制Th1細(xì)胞形成過(guò)程中起核心作用。CD4+T細(xì)胞僅表達(dá)低水平的GATA-3,當(dāng)CD4+T細(xì)胞向Th2分化時(shí)該表達(dá)上調(diào),而當(dāng)CD4+T細(xì)胞向Thl分化時(shí)該表達(dá)下調(diào),在成熟Thl細(xì)胞中則不能被測(cè)到,故GATA-3僅特異表達(dá)于Th2細(xì)胞。此外,GATA-3既可抑制Thl細(xì)胞分化,亦可促使其向Th2細(xì)胞的極化方向發(fā)生改變,GATA-3在促使Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞極化的同時(shí)抑制了Thl細(xì)胞的極化[23]。在自身免疫性疾病和移植物抗宿主病中,可以觀察到T-bet上升和GATA-3下降現(xiàn)象[24-25]。

    Chakir等[26]發(fā)現(xiàn),在多種產(chǎn)生Th1樣和Th2樣細(xì)胞因子的細(xì)胞中,T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的表達(dá)上調(diào),并且可以比較容易地從混合細(xì)胞群中提取總RNA,通過(guò)RT-PCR的方法測(cè)定,這提示T-bet/GATA-3可以在許多種情況下反映Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡狀況。

    我們采用RT-PCR技術(shù),從轉(zhuǎn)錄水平上測(cè)定Th1、Th2細(xì)胞的調(diào)控因子T-bet mRNA、GATA-3 mRNA的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)ITP患者的PBMC經(jīng)IL-11培養(yǎng)后,T-bet mRNA表達(dá)下降,而GATA-3 mRNA表達(dá)增強(qiáng),T-bet mRNA/GATA-3 mRNA比值下降。

    綜上所述,我們分別通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定Th1、Th2細(xì)胞比例及Th1/Th2比值和RT-PCR方法測(cè)定Th1、Th2細(xì)胞的調(diào)控基因T-bet mRNA和GATA-3 mRNA的表達(dá),從不同的角度表明,IL-11在體外能促使ITP患者CD4+T細(xì)胞從Th1極化優(yōu)勢(shì)向Th2極化優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化,這種轉(zhuǎn)化可能是通過(guò)其調(diào)控基因T-bet mRNA和GATA-3 mRNA來(lái)控制的。這可能是IL-11有效治療ITP的機(jī)制之一。

    [1] Feinglass S, Deodhar A .Treatment of lupus-induced thrombocytopenia with recombinant human interleukin-11[J]. Arthritis Rheum, 2001, 44(1): 170-175.

    [2] Bussel JB, Mukherjee R, Stone AJ. A pilot study of rhuIL-11 treatment of refractory ITP[J]. Am J Hematol, 2001, 66(3):172-177.

    [3] 陳曙平, 何群, 劉戈, 等. 重組人白細(xì)胞介素-11治療慢性難治性特發(fā)性血小板減少性紫癜的臨床觀察[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)工程, 2006, 14(4): 417-418.

    [4] 張秋榮, 吳德沛, 陳令松, 等. IL-11治療慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜的療效觀察[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2006,14(1): 176-178.

    [5] 潘斌華, 石淑文, 湯永民, 等. rhIL-11在兒童特發(fā)性血小板減少性紫癜中的臨床應(yīng)用[J]. 浙江預(yù)防醫(yī)學(xué), 2007, 19(1):53-58.

    [6] 肖紅, 彭秀蘭, 劉華東, 等. 重組人白細(xì)胞介素-11治療成人慢性難治性特發(fā)性血小板減少性紫癜臨床觀察[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 17(8): 993-994, 998.

    [7] Bozza M, Bliss JL, Dorner AJ, et al. Interleukin-11 modulates Th1/Th2 cytokine production from activated CD4+T cells[J]. J Interferon Cytokine Res, 2001, 21(1): 21-30.

    [8] Curti A, Ratta M, Corinti S, et al. Interleukin-11 induces Th2 polarization of human CD4(+) T cells[J]. Blood, 2001,97(9): 2758-2763.

    [9] Trepicchio WL, Ozawa M, Walters IB, et al. Interleukin-11 therapy selectively downregulates type I cytokine proinfl ammatory pathways in psoriasis lesions[J]. J Clin Invest,1999, 104(11): 1527-1537.

    [10] 趙杰, 趙翔宇, 黃曉軍, 等. 白細(xì)胞介素11聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)小鼠異基因骨髓移植后移植物抗宿主病影響的研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 85(35): 2497-2502.

    [11] Shan NN, Zhu XJ, Peng J, et al. Interleukin 18 and interleukin 18 binding protein in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura[J]. Br J Haematol, 2009, 144(5): 755-761.

    [12] Shan NN, Zhu XJ, Wang Q, et al. High-dose dexamethasone regulates interleukin-18 and interleukin-18 binding protein in idiopathic thrombocytopenic purpura[J]. Haematologica, 2009, 94(11): 1603-1607.

    [13] Semple JW, Milev Y, Cosgrave D, et al. Differences in serum cytokine levels in acute and chronic autoimmune thrombocytopenic purpura: relationship to platelet phenotype and antiplatelet T-cell reactivity[J]. Blood, 1996, 87(10): 4245-4254.

    [14] Andersson J. Cytokines in idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP)[J]. Acta Paediatr Suppl, 1998, 424(1): 61-64.

    [15] Panitsas FP, Theodoropoulou M, Kouraklis A, et al. Adult chronic idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) is the manifestation of a type-1 polarized immune response[J].Blood, 2004, 103(7): 2645-2647.

    [16] Guo C, Chu X, Shi Y, et al. Correction of Th1-dominant cytokine profiles by high-dose dexamethasone in patients with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura[J]. J Clin Immunol, 2007, 27(6): 557-562.

    [17] 王寧玲, 戴海明, 祝懷平, 等. 特發(fā)性血小板減少性紫癜患兒Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)[J]. 中華血液學(xué)雜志, 2002,23(9): 486-487.

    [18] Seki N, Miyazaki M, Suzuki W, et a1. IL-4-induced GATA-3 expression is a time-restricted instruction switch for Th2 cell differentiation[J]. Immunology, 2004, 172(10): 6158-6166.

    [19] Zhuang Y, Huang Z, Nishida J, et a1. A continuous T-bet expression is required to silence the interleukin-4-producing potential in T helper type 1 cells[J]. Immunology, 2009,128(1): 34-42.

    [20] Lametschwandtner G, Biedermann T, Schw?rzler C, et a1. Sustained T-bet expression confers polarized human TH2 cells with TH1-like cytokine production and migratory capacities[J]. J Allergy Clin Immunol, 2004, 113(5): 987-994.

    [21] Stevens L, Htut TM, White D, et a1. Involvement of GATA3 in protein kinase C theta-induced Th2 cytokine expression[J]. Eur J Immunol, 2006, 36(12): 3305-3314.

    [22] Szabo SJ, kim ST, Costa GL, et a1. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment[J]. Cell, 2000,100(6): 655-669.

    [23] H?fer T, Nathansen H, L?hning M, et al. GATA-3 transcriptional imprinting in Th2 lymphocytes: a mathematical model[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(14): 9364-9368.

    [24] Lazarevic V, Glimcher LH. T-bet in disease[J]. Nat Immunol, 2011, 12(7): 597-606.

    [25] Ji N, Sosa RA, Forsthuber TG. More than just a T-box: the role of T-bet as a possible biomarker and therapeutic target in autoimmune diseases[J]. Immunotherapy, 2011, 3(3): 435-441.

    [26] Chakir H, Wang H, Lefebvre DE, et a1. T-bet/GATA-3 ratio as a measure of the Th1/Th2 cytokine profi le in mixed cell populations: predominant role of GATA-3[J]. Immunol Methods, 2003, 278(1): 157-169.

    猜你喜歡
    極化比值細(xì)胞因子
    認(rèn)知能力、技術(shù)進(jìn)步與就業(yè)極化
    抗GD2抗體聯(lián)合細(xì)胞因子在高危NB治療中的研究進(jìn)展
    雙頻帶隔板極化器
    比值遙感蝕變信息提取及閾值確定(插圖)
    河北遙感(2017年2期)2017-08-07 14:49:00
    急性心肌梗死病人細(xì)胞因子表達(dá)及臨床意義
    不同應(yīng)變率比值計(jì)算方法在甲狀腺惡性腫瘤診斷中的應(yīng)用
    基于PWM控制的新型極化電源設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)
    細(xì)胞因子在慢性腎缺血與腎小管-間質(zhì)纖維化過(guò)程中的作用
    雙電機(jī)比值聯(lián)動(dòng)控制系統(tǒng)
    極化InSAR原理與應(yīng)用
    国产高清视频在线播放一区| 老司机福利观看| 黄频高清免费视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 免费无遮挡裸体视频| 国产 一区 欧美 日韩| 久久久国产成人精品二区| 91久久精品国产一区二区成人 | 久久久精品大字幕| 成年人黄色毛片网站| 欧美性猛交黑人性爽| 美女大奶头视频| 999久久久精品免费观看国产| 精品日产1卡2卡| 69av精品久久久久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 精品人妻1区二区| 日本熟妇午夜| 高潮久久久久久久久久久不卡| e午夜精品久久久久久久| 久久久久九九精品影院| 亚洲性夜色夜夜综合| 精品国产美女av久久久久小说| 免费在线观看影片大全网站| 欧美日本视频| 国产综合懂色| 欧美中文综合在线视频| 欧美乱妇无乱码| 99国产综合亚洲精品| 十八禁网站免费在线| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 又紧又爽又黄一区二区| 日日夜夜操网爽| 91麻豆av在线| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美黑人巨大hd| 亚洲av成人av| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产高潮美女av| 国语自产精品视频在线第100页| 脱女人内裤的视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 禁无遮挡网站| 两个人视频免费观看高清| 欧美黑人欧美精品刺激| 香蕉国产在线看| 久久久久久久久久黄片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99视频精品全部免费 在线 | 久久中文看片网| www.自偷自拍.com| 全区人妻精品视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 91久久精品国产一区二区成人 | 熟女电影av网| 91九色精品人成在线观看| 亚洲在线自拍视频| 久久草成人影院| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 18禁美女被吸乳视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 成人无遮挡网站| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品九九99| 亚洲激情在线av| 国内精品一区二区在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 在线观看午夜福利视频| 亚洲av成人av| 国产一区二区三区视频了| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 午夜福利在线观看吧| 岛国在线免费视频观看| 欧美激情在线99| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲精品粉嫩美女一区| 色吧在线观看| 在线免费观看的www视频| 在线永久观看黄色视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲成人免费电影在线观看| 小说图片视频综合网站| 欧美不卡视频在线免费观看| 黄色日韩在线| 激情在线观看视频在线高清| 国产毛片a区久久久久| 日韩国内少妇激情av| 一区二区三区国产精品乱码| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 日韩欧美在线二视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 性欧美人与动物交配| 国产亚洲欧美98| 最新在线观看一区二区三区| 99久久综合精品五月天人人| 99久久综合精品五月天人人| 91麻豆av在线| x7x7x7水蜜桃| 精品欧美国产一区二区三| 久久性视频一级片| 丝袜人妻中文字幕| 国产成人影院久久av| 高清毛片免费观看视频网站| 又大又爽又粗| 美女cb高潮喷水在线观看 | 无限看片的www在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 天堂影院成人在线观看| 男女那种视频在线观看| 91老司机精品| 久久久久久久久免费视频了| 一本精品99久久精品77| 真实男女啪啪啪动态图| 欧美大码av| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 成人亚洲精品av一区二区| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产高清videossex| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| svipshipincom国产片| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲av电影不卡..在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产人伦9x9x在线观看| svipshipincom国产片| 久久伊人香网站| 99热这里只有精品一区 | 国产成人精品久久二区二区免费| 国产av麻豆久久久久久久| 淫妇啪啪啪对白视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产伦精品一区二区三区四那| 99精品在免费线老司机午夜| av中文乱码字幕在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 在线观看66精品国产| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产乱人伦免费视频| av天堂中文字幕网| 欧美三级亚洲精品| 999精品在线视频| 国产乱人视频| 波多野结衣高清无吗| 最好的美女福利视频网| av天堂在线播放| 村上凉子中文字幕在线| 男人舔女人的私密视频| 日韩精品青青久久久久久| 成人三级黄色视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 热99在线观看视频| 久久99热这里只有精品18| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲一区二区三区色噜噜| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 成人三级黄色视频| 床上黄色一级片| 国产精品综合久久久久久久免费| 精品不卡国产一区二区三区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 欧美最黄视频在线播放免费| 中文字幕高清在线视频| 香蕉久久夜色| 免费看光身美女| 欧美日韩黄片免| 国产爱豆传媒在线观看| 男女午夜视频在线观看| 亚洲美女视频黄频| 亚洲精品色激情综合| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 观看美女的网站| 欧美黑人巨大hd| 久9热在线精品视频| 三级毛片av免费| 午夜福利成人在线免费观看| 观看免费一级毛片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 中文字幕高清在线视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美精品啪啪一区二区三区| 午夜两性在线视频| 国内精品美女久久久久久| 好男人电影高清在线观看| 午夜影院日韩av| 在线永久观看黄色视频| 久久香蕉国产精品| 一夜夜www| 欧美zozozo另类| 国产亚洲av嫩草精品影院| 可以在线观看的亚洲视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 免费av不卡在线播放| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影 | 成人特级黄色片久久久久久久| 不卡一级毛片| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 午夜免费成人在线视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 搡老岳熟女国产| 天堂√8在线中文| 久久九九热精品免费| av天堂在线播放| 热99在线观看视频| 床上黄色一级片| 一个人免费在线观看电影 | 99久久99久久久精品蜜桃| 曰老女人黄片| 在线观看66精品国产| 91字幕亚洲| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久亚洲精品不卡| 久久天堂一区二区三区四区| 成人一区二区视频在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| netflix在线观看网站| 国产乱人伦免费视频| 日韩免费av在线播放| www日本黄色视频网| 亚洲av成人av| 男女视频在线观看网站免费| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 免费看日本二区| 国产av一区在线观看免费| 午夜日韩欧美国产| 午夜免费成人在线视频| 一a级毛片在线观看| 久久中文看片网| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日本免费a在线| 日韩高清综合在线| 欧美3d第一页| 在线播放国产精品三级| 看黄色毛片网站| 久久香蕉精品热| av中文乱码字幕在线| 亚洲18禁久久av| 日本a在线网址| 欧美日韩一级在线毛片| 精品日产1卡2卡| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产精品98久久久久久宅男小说| 一区二区三区高清视频在线| av欧美777| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 中国美女看黄片| 精品无人区乱码1区二区| 久久伊人香网站| 波多野结衣巨乳人妻| 熟女电影av网| 波多野结衣高清作品| 成人无遮挡网站| 欧美一级毛片孕妇| 一级毛片精品| 麻豆成人av在线观看| 美女大奶头视频| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲国产欧美一区二区综合| bbb黄色大片| 最新美女视频免费是黄的| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美午夜高清在线| 观看美女的网站| 熟女人妻精品中文字幕| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲av成人一区二区三| 动漫黄色视频在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 18禁美女被吸乳视频| 国产亚洲精品久久久com| 女人被狂操c到高潮| 99精品在免费线老司机午夜| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久精品人妻少妇| 深夜精品福利| av视频在线观看入口| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产激情久久老熟女| 看片在线看免费视频| 欧美不卡视频在线免费观看| www.自偷自拍.com| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| www.www免费av| 国产97色在线日韩免费| 国产精品一区二区免费欧美| 手机成人av网站| 午夜影院日韩av| 国产av不卡久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 中文在线观看免费www的网站| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 美女免费视频网站| or卡值多少钱| 真人一进一出gif抽搐免费| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 成人高潮视频无遮挡免费网站| ponron亚洲| 久久中文看片网| 色播亚洲综合网| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲av五月六月丁香网| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲av免费在线观看| 欧美黑人巨大hd| 99久久综合精品五月天人人| 一级毛片高清免费大全| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久水蜜桃国产精品网| 男女视频在线观看网站免费| 久久久国产成人精品二区| 人人妻人人看人人澡| 国产高潮美女av| 免费高清视频大片| a在线观看视频网站| 午夜久久久久精精品| 国产精品乱码一区二三区的特点| 最好的美女福利视频网| 亚洲无线在线观看| 后天国语完整版免费观看| 午夜久久久久精精品| 一二三四在线观看免费中文在| www日本黄色视频网| 精品免费久久久久久久清纯| 黄色片一级片一级黄色片| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 夜夜夜夜夜久久久久| 麻豆成人av在线观看| 久久久色成人| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| www日本在线高清视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产av不卡久久| 国产真实乱freesex| 高清在线国产一区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 日韩精品青青久久久久久| 90打野战视频偷拍视频| 三级毛片av免费| 人人妻人人看人人澡| 午夜免费成人在线视频| 九九热线精品视视频播放| 三级毛片av免费| 成人欧美大片| 国产爱豆传媒在线观看| 久久久久久国产a免费观看| e午夜精品久久久久久久| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产精品久久久av美女十八| 成人午夜高清在线视频| 首页视频小说图片口味搜索| www.精华液| 999精品在线视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 精品无人区乱码1区二区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 成年女人看的毛片在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 九色成人免费人妻av| 美女 人体艺术 gogo| 一区二区三区国产精品乱码| www.自偷自拍.com| 偷拍熟女少妇极品色| www.精华液| 国产精品久久久久久久电影 | www.自偷自拍.com| 久久中文字幕一级| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲色图av天堂| 久久天堂一区二区三区四区| 毛片女人毛片| 99热精品在线国产| 午夜福利在线在线| 精品国产乱码久久久久久男人| 人妻久久中文字幕网| 在线a可以看的网站| 一进一出好大好爽视频| 最近在线观看免费完整版| 欧美最黄视频在线播放免费| 97碰自拍视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 黄色 视频免费看| a级毛片a级免费在线| www国产在线视频色| 国产视频一区二区在线看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久久国产成人精品二区| 一级黄色大片毛片| 天堂动漫精品| 首页视频小说图片口味搜索| 黄色日韩在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 美女高潮的动态| 国产亚洲av高清不卡| 淫秽高清视频在线观看| 91麻豆av在线| 久久精品91蜜桃| 黄色视频,在线免费观看| 日本在线视频免费播放| 欧美一区二区精品小视频在线| 日本a在线网址| 99热这里只有是精品50| 97碰自拍视频| 日韩av在线大香蕉| 99热这里只有是精品50| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲黑人精品在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美乱色亚洲激情| 草草在线视频免费看| 精品熟女少妇八av免费久了| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产精品久久久久久精品电影| 青草久久国产| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 午夜免费观看网址| 在线看三级毛片| 成年女人看的毛片在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 一本久久中文字幕| 国产亚洲精品综合一区在线观看| avwww免费| av女优亚洲男人天堂 | 欧美黄色片欧美黄色片| 99久久国产精品久久久| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 一进一出好大好爽视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品国产高清国产av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲美女黄片视频| 草草在线视频免费看| 国产视频内射| 在线国产一区二区在线| 黄色女人牲交| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日本在线视频免费播放| 国产高清videossex| 日日夜夜操网爽| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 人人妻人人澡欧美一区二区| 99精品久久久久人妻精品| 黄色丝袜av网址大全| 大型黄色视频在线免费观看| 九九热线精品视视频播放| 高清在线国产一区| 午夜福利在线在线| 性色avwww在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品,欧美在线| e午夜精品久久久久久久| 亚洲电影在线观看av| 狠狠狠狠99中文字幕| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日本 av在线| 一进一出抽搐动态| 一二三四在线观看免费中文在| 久久久水蜜桃国产精品网| 男人的好看免费观看在线视频| 国产伦在线观看视频一区| 国产午夜精品久久久久久| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲精品在线美女| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 免费搜索国产男女视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产成人欧美在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲 欧美一区二区三区| 一a级毛片在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产精品久久久久久久电影 | 欧美黄色片欧美黄色片| 精品日产1卡2卡| 日本五十路高清| 男插女下体视频免费在线播放| 国产免费男女视频| 久久久国产精品麻豆| 国产高清videossex| 日韩成人在线观看一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线 | 99久久99久久久精品蜜桃| 他把我摸到了高潮在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 精品不卡国产一区二区三区| 欧美成人性av电影在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 99精品在免费线老司机午夜| 香蕉av资源在线| 精品久久久久久成人av| av天堂在线播放| 桃红色精品国产亚洲av| 国产免费男女视频| 视频区欧美日本亚洲| 国产精品一区二区免费欧美| 啦啦啦免费观看视频1| e午夜精品久久久久久久| 日本免费一区二区三区高清不卡| 美女cb高潮喷水在线观看 | 国产精品日韩av在线免费观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 五月伊人婷婷丁香| 99久久精品国产亚洲精品| 色哟哟哟哟哟哟| 黄片大片在线免费观看| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产精品电影一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 日本三级黄在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲成av人片免费观看| 精品不卡国产一区二区三区| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 色吧在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日本 av在线| 99久国产av精品| 久久久久亚洲av毛片大全| 一级作爱视频免费观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久久久国内视频| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 超碰成人久久| 亚洲七黄色美女视频| 又黄又粗又硬又大视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲无线观看免费| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久久久久国产a免费观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 香蕉av资源在线| 精品久久久久久久久久久久久| 草草在线视频免费看| 欧美极品一区二区三区四区| 成人三级黄色视频| 久久草成人影院| 一级a爱片免费观看的视频| 免费看日本二区| 草草在线视频免费看| 操出白浆在线播放| 日韩欧美 国产精品| 熟女人妻精品中文字幕| 精品电影一区二区在线| 亚洲人与动物交配视频| 国产高潮美女av| 久99久视频精品免费| 日韩免费av在线播放| 日韩有码中文字幕| 91字幕亚洲| 国内精品久久久久久久电影| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久久性生活片| 久久人人精品亚洲av| 免费看日本二区| av国产免费在线观看| 国产精品久久电影中文字幕| 国产一区二区在线观看日韩 | or卡值多少钱| 成人永久免费在线观看视频| 日本免费a在线| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 91在线精品国自产拍蜜月 | 国产亚洲精品av在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 91九色精品人成在线观看| 观看美女的网站| 成人国产综合亚洲| 最近最新免费中文字幕在线| 女同久久另类99精品国产91|