全相合異基因造血干細胞移植后免疫重建的研究

衛(wèi)蓓文，唐 暐，彭奕冰，胡 炯

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院血液科骨髓移植病區(qū)，上海200025;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海200025)

造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)目前被廣泛用于治療血液病，影響預(yù)后的一個重要因素是患者免疫功能的重建。如果免疫重建延遲，可能會增加感染風(fēng)險、移植后疾病復(fù)發(fā)及繼發(fā)惡性腫瘤[1]。在異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)時為了預(yù)防移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)發(fā)生，會對移植物做T細胞體外剔除或應(yīng)用大量免疫抑制劑體內(nèi)去除T細胞，均在一定程度上導(dǎo)致免疫重建延遲。目前國內(nèi)外HSCT后免疫重建研究報道尚少且結(jié)論并不一致。本研究檢測并分析了allo-HSCT前后2年內(nèi)患者淋巴細胞亞群的變化及免疫球蛋白水平變化，以期尋找免疫重建規(guī)律與相應(yīng)臨床指標間的聯(lián)系，為移植術(shù)前后免疫重建的監(jiān)測、免疫抑制劑的應(yīng)用和調(diào)整、移植后感染及GVHD預(yù)防和治療等提供重要的參考數(shù)據(jù)。

材料和方法

一、研究對象

入選2009至2013年在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院血液科骨髓移植病區(qū)進行的42例具有完整免疫重建隨訪數(shù)據(jù)的allo-HSCT患者，其中男27例，女15例，年齡(33±12)歲，最小15歲，最大58歲。納入患者中急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)18 例、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)15 例、慢性粒細胞淋巴細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)7例、非霍奇金淋巴瘤(nonhodgkin's lymphoma，NHL)1例，骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndromes，MDS)1例。移植供體來源為同胞移植全相合13例，無血緣關(guān)系全相合29例。所有研究對象移植后發(fā)生感染7例、嚴重排異(Ⅲ～ⅣGVHD)11例、植入不良6例，復(fù)發(fā)5例。最短隨訪期3個月，最長36個月，中位隨訪期12個月。

二、方法

1.預(yù)處理方案 以白消安+環(huán)磷酰胺為基礎(chǔ)的清髓性預(yù)處理29例(69%)，劑量為:白消安每天3.2 mg/kg持續(xù)4 d、環(huán)磷酰胺每天60 mg/kg持續(xù)2 d;以氟達拉濱+白消安+阿糖胞苷為主預(yù)處理13例(31%)，劑量為:氟達拉濱25 mg/m2持續(xù)5 d、白消安每天3.2 mg/kg持續(xù)3 d、阿糖胞苷2 g/m2持續(xù)5 d。

2.GVHD的預(yù)防 環(huán)孢菌素A+嗎替麥考酚酯+短程氨甲喋呤，自第－1天開始每天持續(xù)靜脈應(yīng)用環(huán)孢菌素A 3 mg/kg，調(diào)整劑量維持谷濃度在200～300 ng/mL，口腔潰瘍愈合及胃腸道反應(yīng)消失后改為口服;如無GVHD發(fā)生，則于干細胞回輸后3個月起逐漸減量，移植后5～6個月停用。第+1天始應(yīng)用嗎替麥考酚酯1.0 g/次，每12小時服用1次，移植后1～2個月停藥(同胞全相合移植1個月;非血緣2個月)。第+1天予氨甲喋呤15 mg/m2;第+3、+6、+11天各予氨甲喋呤10 mg/m2靜脈注射。非血緣供體移植患者加用抗胸腺球蛋白，第－4天～第－1天給藥，總劑量6 mg/kg。

3.免疫重建的檢測 (1)于預(yù)處理前，移植后1、3、6、12及24個月分別檢測患者外周血血清IgG、IgA、IgE及IgM水平。檢測方法為速率散射比濁法，儀器為貝克曼-庫爾特公司 IMMAGE 800;(2)于預(yù)處理前，移植日，移植后14及21 d和 1、3、6、12、18 及 24 個月分別檢測患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD16+、CD56+、CD19+細胞。檢測方法為六色直接免疫熒光法，儀器為BD公司CantoⅡ流式細胞儀。抗體選用BD公司生產(chǎn)的六色單克隆抗體 CD45-藻紅蛋白-花青素(phycoerythrin and cyanidin，PC5)和 CD3-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/CD16+56-藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)。無菌采集患者外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝。標本按如下方式操作:①試管中加入5μL單克隆抗體CD45/CD4/CD8/CD3/CD56+CD16/CD19;②加入已混勻的30μL抗凝血;③避光室溫孵育15～20 min;④加入200μL工作濃度的溶血素，振蕩器上混勻，室溫避光放置10～15 min后加入200μL磷酸鹽緩沖液振蕩混勻，上機操作。結(jié)果為陽性百分數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間計量資料的比較采用t檢驗，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和范圍表示，組間計量資料的比較采用Mann-Whitney U檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、移植前后患者外周血免疫球蛋白水平

allo-HSCT后患者IgM恢復(fù)較快，1個月恢復(fù)正常;IgG移植后1個月水平偏低，至3個月左右恢復(fù)正常;IgA恢復(fù)較慢，移植后6個月內(nèi)水平持續(xù)低下，6個月左右恢復(fù)正常。IgE在移植前以及移植后未見明顯變化，在移植后6個月呈現(xiàn)逐步升高趨勢。見表1。

二、移植前后患者外周血淋巴細胞亞群及自然殺傷(natural killer，NK)細胞水平

allo-HSCT后患者14 d內(nèi)CD3+T細胞明顯降低，移植后14 d至1個月開始逐步恢復(fù)正常，而術(shù)后1個月至1年內(nèi)水平稍高于正常水平，至移植后2年趨于恢復(fù)正常;CD3+CD4+T細胞亞群移植后恢復(fù)緩慢，自移植后14 d起恢復(fù)，大部分患者在2年內(nèi)低于或接近正常水平，小部分患者恢復(fù)正常。CD3+CD8+T細胞亞群恢復(fù)較快，移植后14 d內(nèi)水平低下，大部分患者自14 d開始恢復(fù)正常并在2年內(nèi)略高于正常水平。CD56+CD16+細胞移植后恢復(fù)較快，21 d左右開始恢復(fù)或接近正常水平。CD19+細胞在移植后6個月內(nèi)降低，6個月恢復(fù)正常。見表2。

三、預(yù)后良好患者淋巴細胞亞群恢復(fù)情況

在隨訪的42例患者中，21例患者外周血干細胞移植后恢復(fù)過程中未發(fā)生嚴重感染、重度GVHD、植入不良以及復(fù)發(fā)。將上述患者移植前后T淋巴細胞亞群變化趨勢總結(jié)發(fā)現(xiàn)，移植日T細胞亞群檢測水平均極低，外周血幾乎檢測不到各種淋巴細胞表面標志物的表達。CD3+、CD3+CD8+T淋巴細胞及CD56+CD16+細胞均在術(shù)后1個月恢復(fù)正常水平，并在術(shù)后2年內(nèi)水平較穩(wěn)定。CD3+CD4+T細胞術(shù)后1個月接近正常水平，雖與術(shù)后發(fā)生各種并發(fā)癥患者比較未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異，但其總體水平較高，中位數(shù) 26.3(4.0～55.2)%，后者 21.0(0.7 ～ 69.2)%。CD19+細胞在術(shù)后半年恢復(fù)并在2年內(nèi)持續(xù)升高。見圖1。

表1 移植前后外周血免疫球蛋白檢測結(jié)果 [IgG、IgA、IgM:±s;IgE:中位數(shù)(范圍)]

表1 移植前后外周血免疫球蛋白檢測結(jié)果 [IgG、IgA、IgM:±s;IgE:中位數(shù)(范圍)]

檢測時間預(yù)處理前指標個月IgG(mg/mL) 11.64 ±3.68 7.28 ±2.1 11.19 ±3.74 12.66 ±3.46 1移植后1個月 3個月 6個月 12個月 24 3.36 ±5.61 11.46 ±4.94 IgA(mg/mL) 1.72 ±1.01 0.73 ±0.38 0.75 ±0.51 0.84 ±0.51 1.83 ±1.48 1.93 ±1.43 IgM(mg/mL) 0.96 ±0.70 0.65 ±0.36 0.78 ±0.63 1.15 ±0.96 1.11 ±0.93 0.98 ±0.53 IgE(IU/mL) 21(5～418) 20(5～838) 19(6～4 730) 32(5～10 100) 64(5～5 220) 90(5～7 500)

表2 移植前后外周血淋巴細胞亞群檢測結(jié)果 [中位數(shù)(范圍)]

圖1 預(yù)后良好患者淋巴細胞亞群變化圖

四、免疫重建影響因素分析

本研究就免疫重建可能相關(guān)因素進行了系列的分析，包括性別、年齡、干細胞來源、感染以及是否發(fā)生GVHD。42例患者中男27例，女15例，移植后各階段檢測中血清免疫球蛋白水平及淋巴細胞亞群恢復(fù)上無明顯差異。年齡分布＞45歲者7人，＜45歲者35人，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn) CD3+及 CD3+CD4+T淋巴細胞恢復(fù)上兩者無差異，但＞45歲的患者CD3+CD8+細胞恢復(fù)趨勢上慢于＜45歲的患者，術(shù)后 1個月前者中位數(shù) 27.0(18.2～38.5)%，后者為 38.3(7.8 ～ 80.9)%(P=0.011)，術(shù)后3個月兩者無明顯差異。

在42例人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)全相合移植中，同胞移植13例，非血緣移植29例，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)同胞移植患者術(shù)后T淋巴細胞恢復(fù)較非血緣移植快，移植后14 d已開始恢復(fù)，CD3+細胞為 79.2(0.0 ～98.1)%，非血緣移植者為 46.4(0.0 ～ 90.0)%(P=0.004);CD3+CD4+細胞同胞移植者 30.3(0.0～80.3)%，非血緣移植者 12.7(0.0 ～ 64.3)%(P=0.000);移植后1個月CD3+細胞兩者無明顯差異，而CD3+CD4+細胞依然差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，非血緣移植患者大多數(shù)未恢復(fù)，僅為12.9(0.7 ～12.4)%，同胞移植者為 29.4(22.5～45.2)%;直至移植后 3 個月兩者 CD3+CD4+細胞水平無明顯差異。CD3+CD8+細胞非血緣移植者恢復(fù)稍慢于同胞移植，至術(shù)后半年兩者無明顯差異。

移植后發(fā)生嚴重感染患者7例，均發(fā)生于移植后3個月內(nèi)。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)在移植后1個月發(fā)生感染患者CD3+CD8+細胞水平明顯高于未發(fā)生感染患者，感染患者為 55.7(37.7 ～87.5)%，未發(fā)生嚴重感染患者為 26.3(7.8～74.5)%(P=0.028)。

移植后發(fā)生Ⅲ～Ⅳ嚴重GVHD患者其移植后早期14 d CD3+細胞水平明顯高于未發(fā)生嚴重GVHD患者，發(fā)生GVHD患者CD3+細胞為86.9(0.0 ～94.8)%，未發(fā)生嚴重 GVHD 患者為 64.5(0.0 ～96.3)%(P=0.009);重度 GVHD 患者移植后14 d CD3+CD8+細胞水平明顯高于未發(fā)生嚴重GVHD患者，重度GVHD患者為29.3(0.0～66.4)%，未發(fā)生嚴重 GVHD 患者為11.3(0.0 ～56.3)%(P=0.003)。CD3+CD4+細胞雖然兩者未發(fā)現(xiàn)明顯差異，但未發(fā)生嚴重GVHD患者術(shù)后1個月總體水平高于發(fā)生嚴重GVHD患者，前者為 21.5(4.0 ～ 69.2)%，后者為 17.0(4.0 ～50.8)%。

討 論

HSCT是治療血液系統(tǒng)惡性疾病、實體瘤、先天性代謝疾病的重要手段之一，移植術(shù)后免疫系統(tǒng)重建是移植成功的關(guān)鍵之一[2]。免疫重建包括細胞和體液的免疫重建[3]:(1)T細胞數(shù)量及功能的恢復(fù);(2)B細胞數(shù)量及功能的恢復(fù);(3)NK細胞免疫功能的重建;(4)免疫系統(tǒng)有效抗原表達。Schlenke等[4]報道移植后NK細胞恢復(fù)最快，移植后2～4周開始回升，1個月其數(shù)量和功能可以達到甚至略高于正常水平。B細胞基本可在6至12個月內(nèi)恢復(fù)[5]，也有報道需要1年以上時間[2]。T細胞既是細胞免疫的重要參與者，也是體液免疫的調(diào)節(jié)者，因此T細胞的免疫重建必須受到關(guān)注。不同T細胞亞群移植后恢復(fù)情況具有異質(zhì)性，CD3+細胞一般在移植后3～6個月恢復(fù)正常水平[6]，CD3+CD4+T細胞亞群移植后恢復(fù)緩慢，移植術(shù)后1至2年內(nèi)仍處于持續(xù)低水平，甚至2至5年才恢復(fù)[7]，CD3+CD8+T細胞亞群則移植后重建相對較快，術(shù)后3個月可開始恢復(fù)正常水平[8]。

本研究監(jiān)測了42例在瑞金醫(yī)院骨髓移植中心做allo-HSCT的患者移植前后T細胞亞群、NK細胞、B細胞及免疫球蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)CD3+和CD3+CD8+淋巴細胞在移植后1個月左右均已恢復(fù)至正常水平，比相關(guān)報道得到的數(shù)據(jù)要早，尤其移植后無顯著并發(fā)癥的患者，并且恢復(fù)后在隨訪期間也未出現(xiàn)明顯波動。這一結(jié)果僅反映移植后無感染和嚴重GVHD等并發(fā)癥患者正常免疫重建的特征，而一旦出現(xiàn)嚴重感染和GVHD，CD3+CD8+細胞的恢復(fù)則出現(xiàn)顯著偏移，而感染病例CD3+CD8+細胞則異常增高。相反CD3+CD4+T淋巴細胞移植后恢復(fù)總體較慢，與國內(nèi)外其他報道一致，多數(shù)自2周起開始緩慢恢復(fù)，但在隨訪期間多數(shù)患者始終處于相對低水平并未恢復(fù)至正常范圍。這一現(xiàn)象可能是與allo-HSCT患者移植前必須接受大劑量化療和免疫抑制劑，尤其是非血緣供體接受抗胸腺球蛋白治療導(dǎo)致胸腺功能受抑有關(guān)。移植后T細胞免疫重建途徑主要有2條:(1)外周途徑。不依賴胸腺功能，移植物中T細胞受到抗原刺激后在外周免疫器官內(nèi)增殖;(2)胸腺依賴途徑。淋巴樣細胞遷移至胸腺，在胸腺內(nèi)發(fā)育為初始淋巴細胞，從而形成穩(wěn)定持久的免疫重建。因此移植后胸腺的再生能力受損，胸腺輸出功能下降甚至喪失，體內(nèi)淋巴細胞極度缺乏，激化了機體自穩(wěn)機制，體內(nèi)殘余淋巴細胞及來自于供體少數(shù)淋巴細胞在外周血中發(fā)生穩(wěn)態(tài)性增殖，由于CD8+細胞增殖不顯著依賴于胸腺功能而移植后較快恢復(fù)，但CD4+細胞依賴于胸腺功能而恢復(fù)緩慢[9]，這也部分解釋了移植后患者在較長時期內(nèi)CD4/CD8比值下降及倒置的原因。

本研究發(fā)現(xiàn)CD19+細胞在移植后6個月內(nèi)得以恢復(fù)，但IgG水平先于B細胞恢復(fù)，這一原因可能與較多的患者移植后曾經(jīng)靜脈注射免疫球蛋白制劑有關(guān)。IgA水平恢復(fù)相對緩慢，一般于6個月左右升至正常，與B細胞恢復(fù)時間同步。NK細胞恢復(fù)則較快，多數(shù)患者于移植后1個月恢復(fù)，部分患者在1至3個月間水平高于正常，與前述報道相一致。

本研究在對免疫重建的相關(guān)影響因素分析中發(fā)現(xiàn)，不同性別患者移植后免疫重建無顯著差異。既往認為年齡大者由于免疫重建功能較差，且其功能臟器欠佳不適合行HSCT，但本研究發(fā)現(xiàn)＞45歲的移植患者移植后CD3+及CD3+CD4+T淋巴細胞恢復(fù)趨勢上與年輕患者無明顯差異，雖然移植術(shù)后1個月＞45歲患者CD3+CD8+T淋巴細胞水平明顯低于＜45歲患者，但均達到正常范圍。因此隨著預(yù)處理方法及移植技術(shù)的改進，HSCT后免疫重建問題對年老患者不是限制性因素。此外研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生Ⅲ～Ⅳ嚴重GVHD患者，其移植后14 d CD3+細胞明顯高于未發(fā)生GVHD患者，而患者大多于術(shù)后3周至1個月左右發(fā)生Ⅲ～ⅣGVHD。在實體器官移植如腎移植術(shù)后也有報道發(fā)現(xiàn)發(fā)生排斥反應(yīng)時CD3+細胞會增高[10]，因此CD3+細胞相對增高對移植后發(fā)生的排斥反應(yīng)或GVHD可能均有預(yù)示作用。發(fā)生嚴重GVHD患者其免疫重建延遲，特別是 CD3+CD4+T淋巴細胞重建影響尤為明顯，可能與大劑量激素或其他免疫抑制劑治療GVHD導(dǎo)致的免疫抑制有關(guān)[11]，本研究雖未發(fā)現(xiàn)是否發(fā)生GVHD間存在統(tǒng)計學(xué)差異，但在移植后1個月和2年內(nèi)的趨勢發(fā)現(xiàn)發(fā)生GVHD組與未發(fā)生GVHD組比較，均呈現(xiàn)降低的趨勢，與 Jiménez等[12]的報道一致。早期發(fā)生嚴重感染和未發(fā)生感染的患者比較，發(fā)現(xiàn)前者CD3+CD8+細胞明顯增高并超過正常水平，與Servais等[13]的報道有相似發(fā)現(xiàn)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)allo-HSCT后淋巴細胞亞群的免疫重建順序依次是:CD56+CD16+、CD3+CD8+、CD19+及 CD3+CD4+。HLA全相合有利于免疫重建，移植治療中抗胸腺球蛋白的應(yīng)用、移植后GVHD發(fā)生等是影響免疫重建的最重要因素，術(shù)后早期過高表達的CD3+CD8+細胞可能可以作為預(yù)示GVHD及感染的因子。移植后免疫重建的問題近年來已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究熱點之一，了解allo-HSCT后免疫重建規(guī)律有助于提前干預(yù)治療，減少GVHD及感染乃至復(fù)發(fā)。

[1]Oevermann L，Lang P，F(xiàn)euchtinger T，et al.Immune reconstitution and strategies for rebuilding the immune system after haploidentical stem cell transplantation[J].Ann N Y Acad Sci，2012，1266:161-170.

[2]Bosch M，Khan FM，Storek J.Immune reconstitution after hematopoietic cell transplantation[J].Curr Opin Hematol，2012，19(4):324-335.

[3]Barocci S，Valente U，Nocera A.Detection and analysis of HLA classⅠ and classⅡ specific alloantibodies in the sera of dialysis recipients waiting for a renal retransplantation[J].Clin Transplant，2007，21(1):47-56.

[4]Schlenke P，Sheikhzadeh S，Weber K，et al.Immune reconstitution and production of intracellular cytokines in T lymphocyte populations following autologous peripheral blood stem cell transplantation[J].Bone Marrow Transplant，2001，28(3):251-257.

[5]Storek J，Dawson MA，Storer B，et al.Immune reconstitution after allogeneic marrow transplantation compared with blood stem cell transplantation[J].Blood，2001，97(11):3380-3389.

[6]孫自敏，王祖貽，劉會蘭，等.異基因造血干細胞移植治療惡性血液病[J].臨床血液學(xué)雜志，2004，17(5):257-260.

[7]Mazzolari E，F(xiàn)orino C，Guerci S，et al.Long-term immune reconstitution and clinical outcome after stem cell transplantation for severe T-cell immunodeficiency[J].J Allergy Clin Immunol，2007，120(4):892-899.

[8]Peggs KS，Verfuerth S，Pizzey A，et al.Reconstitution ofT-cellrepertoire after autologous stem cell transplantation:influence of CD34 selection and cytomegalovirus infection[J].Biol Blood Marrow Transplant，2003，9(3):198-205.

[9]Laurent J，Speiser DE，Appay V，et al.Impact of 3 different short-term chemotherapy regimens on lymphocyte-depletion and reconstitution in melanoma patients[J].J Immunother，2010，33(7):723-734.

[10]Tian J，Shi WF，Zhang LW，et al.HLA classⅠ(ABC)upregulation on peripheral blood CD3+/CD8+T lymphocyte surface is a potential predictor of acute rejection in renal transplantation [J].Transplantation，2009，88(12):1393-1397.

[11]Gaidot A，Landau DA，Martin GH，et al.Immune reconstitution is preserved in hematopoietic stem cell transplantation coadministered with regulatory T cells for GVHD prevention[J].Blood，2011，117(10):2975-2983.

[12]Jiménez M，Ercilla G，Martínez C.Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens[J].Leukemia，2007，21(8):1628-1637.

[13]Servais S，Lengline E，Porcher R，et al.Long-term immune reconstitution and infection burden after mismatched hematopoietic stem cell transplantation[J].Biol Blood Marrow Transplant，2014，20(4):507-517.