胞外ATP在小鼠急性肝損傷中的表達及意義

胡梅琮，鄒玲莉，黃保軍，王 磊

(1.浙江醫(yī)學高等?？茖W校醫(yī)學檢驗系，浙江杭州310053;2.南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院海勤療區(qū)，浙江杭州310002;3.安徽醫(yī)科大學免疫學教研室，安徽合肥230032)

細胞內(nèi)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)是重要的能量貯存和供給物質(zhì)，細胞內(nèi)ATP缺失將導致細胞死亡;除此之外，因參與機體神經(jīng)、血管及免疫等系統(tǒng)中細胞間對話，胞外ATP水平會出現(xiàn)瞬間升高[1]。在正常組織中，細胞內(nèi)釋放出的ATP由于胞外ATP(extracellular ATP，eATP)/二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)酶的作用，其濃度總是維持極低水平。當細胞在受損、應激、缺氧等情況下會釋放出大量ATP，并作為內(nèi)源性危險信號通過嘌呤受體P2(P2X7)受體途徑，引起炎癥復合體活化，從而觸發(fā)成熟白細胞介素 1β(interleukin 1beta，IL-1β)的合成和釋放，啟動并進一步放大炎癥反應、維持細胞介導的免疫反應[2]。刀豆蛋白 A(concanavalin A，ConA)是一種植物凝集素，小鼠尾靜脈注射后可引發(fā)急性肝損傷，表現(xiàn)為Kupffer細胞活化及肝組織的大片壞死。在這種明顯的組織損傷及應激微環(huán)境中，是否出現(xiàn)了ATP的釋放?釋放的eATP是否參與ConA誘導急性肝損傷進程?目前尚不清楚。我們以ConA誘導小鼠急性肝損傷為模型，動態(tài)檢測eATP在肝損傷組織中的表達變化，同時觀察其受體P2X7在受損肝組織中的表達，并探尋其與炎癥細胞因子IL-1β之間的關(guān)系，為進一步闡明急性肝損傷發(fā)生的免疫學機制提供實驗依據(jù)。

材料和方法

一、實驗動物

昆明種小鼠72只，7～9周齡，體重22～26 g，雌雄各36只，普通級，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。

二、主要試劑

ConA購自美國Sigma公司;血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒購自長春匯力生物技術(shù)有限公司;小鼠 IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國R＆D公司;ATP檢測試劑盒購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司;兔抗小鼠P2X7抗體購自英國Abcam公司;HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋公司。

三、方法

1.ConA誘導小鼠急性肝損傷模型制備及標本采集 72只昆明種小鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為對照組和ConA組，每組36只。ConA組由尾靜脈處注射ConA，劑量為20 mg/kg;對照組注射同體積的無致熱原生理鹽水(normal saline，NS)。于注射后 2、6、12、18、24、48 h 分別采用乙醚吸入法麻醉小鼠。從小鼠肝門附近的下腔靜脈取血，待血凝固后700×g離心30 min分離血清，進行ALT活性和eATP水平的檢測;頸椎脫臼法處死小鼠后，摘取肝臟，取約100 mg肝組織立即凍入液氮中，用于提取肝組織總蛋白，檢測P2X7蛋白的表達。剩余肝組織置10%中性甲醛中固定，用于蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色進行組織病理學檢查。

2.血清ALT活力檢測 采用賴氏比色法檢測血清ALT活力。具體操作嚴格按試劑盒說明書進行，每份樣本進行雙份檢測，取平均值。

3.HE染色肝組織病理學檢查 取各時間點固定過的肝組織塊，常規(guī)脫水、包埋制成蠟塊，4 μm連續(xù)切片，經(jīng)HE染色后，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察肝臟組織病變情況并拍照。

4.血清eATP水平測定 采用化學發(fā)光技術(shù)檢測血清eATP水平，儀器為GloMax?-Multi Jr化學發(fā)光儀。根據(jù)制定的標準曲線計算樣品中的ATP濃度，嚴格按試劑盒說明書操作。每份樣本進行雙份檢測，取平均值。

5.肝組織中P2X7蛋白水平 采用免疫印跡法檢測肝組織中P2X7蛋白水平。用組織裂解液對肝組織塊進行勻漿后，于4℃ 12 700×g離心30 min，吸取上清肝組織，采用二喹啉甲酸(BCA)法進行總蛋白定量測定。將20 μg蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis， SDSPAGE)，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用5%封閉液封閉3 h，兔抗鼠P2X7抗體4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次;涂ECL試劑于全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)中進行曝光，保存圖像。

6.血清IL-1β水平測定 采用橋聯(lián)法(ABCELISA)檢測血清IL-1β水平。嚴格按試劑盒操作說明進行，每份樣本進行雙份檢測，取平均值。

四、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，用±s表示，兩組間比較使用配對t檢驗，多組間比較使用S-N-K及Tukey檢驗，方差不齊時采用Howell檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、建立ConA誘導小鼠急性肝損傷模型

1.ConA組和對照組小鼠生存狀態(tài)觀察 對照組小鼠48 h內(nèi)無一例死亡，小鼠敏捷好動，食欲正常;而ConA組注射ConA后12 h內(nèi)有3只小鼠死亡，24 h內(nèi)又死亡 2只，累計死亡率為13.9%，存活的小鼠精神萎靡、反應遲緩、體溫較低、鼠毛豎立蓬亂、飲食及飲水均減少。

2.各時間點血清ALT活性的變化 對照組各時間點的血清 ALT為(44.12±9.20)U/L，均在正常范圍內(nèi)波動，未見明顯改變。ConA組注射ConA后2 h即可見ALT活性明顯增高，6～24 h一直維持高水平，至48 h依然明顯高于對照組(P＜0.01)，見圖1。

圖1 對照組和ConA組血清ALT活性比較

3.肝組織病理學檢查 肉眼觀察可見ConA注射后6 h起肝臟明顯腫大，呈深暗紅色，可見點狀或小片狀出血，質(zhì)地更脆，稍碰易碎;24 h后肝臟仍腫脹，較前略顯蒼白。光鏡下對照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，形成肝細胞索，細胞結(jié)構(gòu)正常;ConA組小鼠肝組織呈現(xiàn)典型炎癥病理改變:早期(2、6 h)肝細胞胞質(zhì)疏松，呈現(xiàn)明顯腫脹變性，小葉內(nèi)可見炎性細胞散在或灶狀浸潤，血管內(nèi)充血明顯;至12、18 h肝細胞大片壞死，壞死區(qū)紅細胞堆積、炎細胞浸潤明顯;24、48 h仍可見肝細胞腫脹，排列紊亂，大量炎細胞浸潤，紅細胞堆積。見圖2。

圖2 對照組和ConA組小鼠肝臟病理組織學改變(HE染色，×400)

二、小鼠肝門附近下腔靜脈血清eATP水平檢測

對照組小鼠釋放至肝靜脈血清中的eATP水平非常低，約為 0.7 nmol/L。ConA組在注射ConA 2 h后血清 eATP水平有所增加(約為15 nmol/L)，以后逐漸升高，至18 h出現(xiàn)峰值，達703 nmol/L，隨后緩慢回落，在48 h時依然高于對照組(P ＜0.01)。見表1、圖3。

三、小鼠肝組織中P2X7蛋白水平的變化

采用免疫印跡法檢測小鼠肝組織中P2X7蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在小鼠肝組織內(nèi)表達P2X7受體，但相對于對照組，ConA組注射后各時間點P2X7的表達水平未發(fā)生明顯改變。見圖4。

表1 ConA誘導肝損傷模型中eATP的水平 (±s，nmol/L)

表1 ConA誘導肝損傷模型中eATP的水平 (±s，nmol/L)

注:與對照組比較，*P ＜0.01

時間(h) 組別 例數(shù)6 0.73 ±0.06 ConA 組 6 15.25 ±3.79*6 對照組 6 0.83±0.03 ConA 組 6 45.70 ±7.17*12 對照組 6 0.62±0.03 ConA 組 6 139.41 ±16.93*18 對照組 6 0.74±0.03 ConA 組 6 703.41 ±103.04*24 對照組 6 0.81±0.04 ConA 組 6 87.75 ±5.89*48 對照組 6 0.65±0.04 ConA 組 6 25.17 ±2.23 2 對照組*eATP

圖3 ConA組和對照組eATP的釋放

圖4 ConA組和對照組肝組織中P2X7蛋白的表達

四、小鼠血清IL-1β水平變化

對照組各時間點血清IL-1β水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。ConA組在注射ConA后血清IL-1β水平迅速增高，注射后2～48 h內(nèi)一直維持在較高水平，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖 5。

圖5 ConA組和對照組血清IL-1β水平的變化

討 論

急性肝損傷是一個炎癥級聯(lián)反應過程，發(fā)病機制復雜，涉及多種因素的參與及相互作用，其中固有免疫反應的作用越來越受到人們的重視。固有免疫細胞通過表達模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，可以識別組織細胞在感染、損傷和應激情況下產(chǎn)生的內(nèi)源性危險信號，即損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)，啟動天然免疫及炎癥反應。這是人類炎癥性疾病，尤其是無菌性炎癥的發(fā)病機制之一[3]。

ATP是近來較為關(guān)注的一種DAMP。P2X7受體是ATP門控的陽離子通道蛋白，在單核巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞中均有表達。細胞在受損、應激、缺氧等情況下會釋放出大量ATP，并作為內(nèi)源性危險信號與嘌呤P2X7受體相結(jié)合，引起ATP門控陽離子通道開放，導致鉀離子(K+)外流。胞內(nèi)低K+可激活NLRP3炎癥小體，同時招募pennexin-1介導引起更大的膜通透孔，胞外其他病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)或DAMP可進入胞內(nèi)直接激活NLRP3炎癥小體[4-6]。這是近來發(fā)現(xiàn)的有關(guān)NLRP3炎癥小體的激活機制之一，也是eATP作為DAMP分子參與炎癥性疾病[7]的主要機制。此外，eATP還能誘導吞噬細胞白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)的轉(zhuǎn)錄，在單核細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞的過程中發(fā)揮重要作用;還能引起星形膠質(zhì)細胞中核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)的高表達，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性病變。

ConA尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)后，隨血液循環(huán)迅速到達肝臟，主要激活CD4+T淋巴細胞與Kupffer細胞，產(chǎn)生多種炎性細胞因子[如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、γ-干擾素、白細胞介素2等]，引起免疫性肝損傷[8]。ConA誘導的肝損傷主要表現(xiàn)為Kupffer細胞活化及肝組織的大片壞死。在這種明顯的組織損傷及應激微環(huán)境中，我們推測應該會出現(xiàn)DAMP的大量釋放，且DAMP在ConA誘導的小鼠急性肝損傷機制中應該扮演著重要角色。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)小鼠尾靜脈注射ConA 2 h后即可見血清ALT活性增高，并在48 h內(nèi)一直維持高水平;通過對肝組織HE染色的觀察，結(jié)果也呈現(xiàn)出典型的炎癥病理損傷，說明ConA誘導小鼠急性肝損傷的模型構(gòu)建成功。

進一步檢測小鼠血清中炎癥細胞因子水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清IL-1β水平于注射ConA后2 h即明顯增高，且一直維持高于對照組的水平。IL-1β是一類重要的促炎癥因子，能誘導自身及IL-6、白細胞介素8(interleukin 8，IL-8)、TNF-α 等多種促炎細胞因子和黏附分子的表達。由于IL-1β缺少信號肽，不能通過經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體通路分泌。炎性細胞產(chǎn)生IL-1β主要依賴一種稱為炎癥復合體的多蛋白復合物[9]。NLRP3是目前研究較多的與內(nèi)源性危險信號識別有關(guān)的炎癥復合體之一。體外實驗表明NLRP3依賴的IL-1β產(chǎn)生機制含兩種獨立的信號轉(zhuǎn)導途徑。第一信號:依賴NF-κB的pro-IL-1β的轉(zhuǎn)錄上調(diào);第二信號:由刺激因素特異性引起NLRP3活化，進而激活化caspase-1，活化的caspase-1水解pro-IL-1β形成具有生物活性的IL-1β。而激活NLRP3的一條重要途徑是ATP-P2X7信號途徑[10]。因此，本研究對釋放至肝周圍循環(huán)中的eATP水平進行檢測。結(jié)果顯示對照組血清eATP水平極低，而ConA組注射ConA后2 h即可見eATP水平的增高，并一直維持至48 h，與IL-1β的表達增高的趨勢較一致;同時還檢測到肝組織中有P2X7受體表達。提示在ConA誘導的肝損傷中，釋放至細胞外的ATP的局部水平增高，達到激活P2X7受體的閾值，通過激活NLRP3炎癥復合體，引起IL-1β的分泌。

體內(nèi)外實驗證明，釋放至細胞外的ATP與人類炎癥性疾病息息相關(guān)[11-13]，且新的eATP/P2X7受體軸抑制劑逐漸被發(fā)現(xiàn)和應用，并取得良好的治療效果[14-15]。而本研究發(fā)現(xiàn)eATP在ConA刺激后的小鼠肝組織中表達明顯增加，闡述了eATP誘導炎癥因子IL-1β產(chǎn)生并加重急性肝損傷的機制。臨床上各種原因引起的急性肝損傷都會產(chǎn)生細胞損傷和應激微環(huán)境，從而激發(fā)胞內(nèi)ATP的釋放。后者作為早期危險信號通過引發(fā)炎癥因子的瀑式反應加重損傷，形成惡性循環(huán)，促進疾病的發(fā)展。本研究表明在肝損傷的早期即出現(xiàn)明顯的ATP釋放，提示臨床可將血清ATP作為新的肝損傷的輔助診斷指標，同時為制定以抑制ATP釋放或封閉其相應作用抗體為靶點的治療急性肝損傷的新策略提供了理論依據(jù)和實驗思路。但在ConA誘導的急性肝損傷微環(huán)境中還存在很多類型的DAMP(本課題前期工作就證實了HMGB1作為一類DAMP參與了ConA誘導的急性肝損傷進程[16])。這些DAMPs相互作用，形成非常復雜的內(nèi)源性危險信號網(wǎng)絡(luò)。因此eATP表達的增加是否是肝損傷中IL-1β分泌的直接啟動因素及eATP與其他DAMPs間的聯(lián)系尚有待進一步深入研究。

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