苜蓿細(xì)菌性病害研究進(jìn)展

張振粉，南志標(biāo)

（草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020）

苜蓿（Medicagosativa）是最重要的多年生豆科牧草，在我國(guó)用作農(nóng)作物的耕作歷史已有兩千多年［1］。苜蓿產(chǎn)量高，具有保持水土和改善土壤結(jié)構(gòu)的功能，是北半球溫帶地區(qū)最主要的牧草和草品產(chǎn)業(yè)化、草田輪作的首選豆科牧草，在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中有著不可替代的作用［2］。病害（真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲(chóng)和寄生性種子植物）是苜蓿生產(chǎn)的主要限制因素之一［3－5］。目前關(guān)于苜蓿病害的研究工作多集中于苜蓿真菌性病害［6－12］，而對(duì)于苜蓿細(xì)菌性病害的研究則較少。據(jù)美國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2010年統(tǒng)計(jì)結(jié)果，苜蓿真菌性病害國(guó)際報(bào)道37種，病毒性病害12種，線蟲(chóng)病害12種，而苜蓿細(xì)菌性病害只有7種。國(guó)外關(guān)于苜蓿細(xì)菌性病害的研究主要包括苜蓿細(xì)菌性萎蔫?。–lavibactermichiganensesubsp．insidiosus）［13］、細(xì)菌性莖疫?。≒seudomonassyringaepv．syringae）［14］、細(xì)菌性芽腐爛?。‥rwiniachrysanthemi）［15］、細(xì)菌性葉斑?。╔anthomonascampestrispv．a(chǎn)lfalfae）［16］、根癌土壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）、冠腐 和 根 腐 綜 合 病 （Pseudomonasviridiflava）和矮 化 病 （Xylellafastidiosa）［17］；國(guó)內(nèi)關(guān)于苜蓿細(xì)菌性病害的研究?jī)H有Zhang和Nan［18］于2012年新報(bào)道的苜蓿細(xì)菌性芽萎蔫病（Erwiniapersicina）以及俞大紱和方中達(dá)［19］、方中達(dá)與任欣正［20］、劉若［21］、南志標(biāo)和員寶華［7］等報(bào)道的危害程度較輕的細(xì)菌性莖疫病和細(xì)菌性葉斑病。

自1925年Jones［22］報(bào)道的苜蓿細(xì)菌性萎蔫病害，之后世界不同國(guó)家陸續(xù)在不同苜蓿種植區(qū)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性萎蔫病。據(jù)Nyvall［17］報(bào)道，苜蓿細(xì)菌性萎蔫病可在所有苜蓿種植區(qū)發(fā)生。隨著苜蓿種植在世界范圍越來(lái)越普及的同時(shí)，各個(gè)國(guó)家對(duì)苜蓿細(xì)菌性萎蔫病保持高度警惕，并且苜蓿上其他細(xì)菌性病害也逐漸受到植物病理學(xué)工作者的重視。目前尤其是國(guó)內(nèi)對(duì)苜蓿細(xì)菌性病害的認(rèn)識(shí)還不是很深入，對(duì)病害種類(lèi)及其特征、防治方法等方面也需要全面的總結(jié)以往的工作，同時(shí)，開(kāi)展包括防治方法在內(nèi)的新的內(nèi)容。本文著重綜述了國(guó)內(nèi)外苜蓿細(xì)菌性病害研究情況，明白其分布及寄主范圍；詳述其癥狀和病原識(shí)別特征；歸納室內(nèi)常見(jiàn)鑒定手段和有效的防治方法；提出了我國(guó)目前急需開(kāi)展的苜蓿細(xì)菌性病害研究的幾點(diǎn)建議；旨在為防止苜蓿細(xì)菌性病害在國(guó)內(nèi)爆發(fā)及流行提供理論基礎(chǔ)，為苜蓿細(xì)菌性病害的防治提供基礎(chǔ)資料。

1 病害種類(lèi)及其特征

1．1 細(xì)菌性芽萎蔫病

癥狀：細(xì)菌性葉斑病主要發(fā)生于芽上。初為苜蓿芽脫水、黃化；在24～48h內(nèi)芽停止生長(zhǎng)、萎蔫、變褐和伴有菌膿溢出。

病原：桃色歐文氏菌（E．persicina）。菌體桿狀，大小為（0．5～1．0）μm×（1．0～3．0）μm。革蘭氏陰性，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜，兼性厭氧型，能運(yùn)動(dòng)。營(yíng)養(yǎng)瓊脂上菌落小，表面微凸，半透明，邊緣整齊。最適生長(zhǎng)溫度為28～30℃，36℃也能生長(zhǎng)，可在5%NaCl營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)。發(fā)酵型，能從葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、甘露醇、蔗糖、甘油產(chǎn)酸，不能從木糖、肌醇、松三糖、苦杏仁苷產(chǎn)酸。氧化酶陰性，接觸酶陽(yáng)性。還原硝酸鹽。不能液化明膠，不產(chǎn)生吲哚、精氨酸雙水解酶、苯丙氨酸脫氨酶以及脲酶。V－P反應(yīng)陽(yáng)性，ONPG反應(yīng)陽(yáng)性。水解酪蛋白。利用檸檬酸鹽。可存活于植物種子［18］。此屬細(xì)菌多為植物致病菌。

1．2 細(xì)菌性芽腐爛病

癥狀：主要發(fā)生于芽上。種子剛萌發(fā)的根上出現(xiàn)半透明的黃色色斑，24～48h之內(nèi)種子變黃，停止生長(zhǎng)緊接著黃化，芽上附著大量細(xì)菌，散出氣味。該病害可通過(guò)種子接觸迅速傳播，可以毀壞苜蓿芽整個(gè)生產(chǎn)［15］。高濕及適合的生長(zhǎng)溫度（28℃）常使腐爛加重，當(dāng)氣溫將至21℃時(shí)，發(fā)病率明顯降低。

病原：菊歐文氏菌（E．chrysanthemi），現(xiàn)為菊果膠桿菌（Pectobacteriumchrysanthemi）。菌體桿狀，大小為（0．5～1．0）μm×（1．0～3．0）μm，圓形末端，單生或?qū)ι?。革蘭氏陰性菌。以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)?？砂l(fā)酵，兼性厭氧。最適生長(zhǎng)溫度為27～30℃，最高生長(zhǎng)溫度40℃。氧化酶陰性，接觸酶陽(yáng)性。可降解蔗糖，水解明膠和果膠，不能降解淀粉?？捎?%的NaCl中微弱生長(zhǎng)。可產(chǎn)生吲哚?？墒柜R鈴薯軟腐，對(duì)紅霉素過(guò)敏。卵磷脂酶和磷酸酶陽(yáng)性，脲酶陰性?？梢詮钠咸烟侵挟a(chǎn)氣。不能從麥芽糖、α－甲基－D－葡萄糖苷、乳糖、衛(wèi)矛醇、海藻糖和帕拉金糖產(chǎn)酸。此屬細(xì)菌可引起植物病害類(lèi)型有，疫病，潰瘍，頂梢枯死，葉斑，萎蔫病，植物組織變色，根腐，莖腐，冠腐和果實(shí)腐爛等。Pierce和Mc Cain［15］報(bào)道，該菌不能在苜蓿種子上存活超過(guò)14d。菊歐文氏菌在菊花（Dendranthemamorifolium）上造成的菊基腐病是我國(guó)重要檢疫性病害之一。

1．3 冠癭病

癥狀：冠癭病又稱根癌病，主要發(fā)生于苜蓿的根部。在苜蓿較大的次生根上形成分枝的瘤狀結(jié)構(gòu)。在交叉的癭上，有褐色不規(guī)則結(jié)構(gòu)的大片區(qū)域。

病原：根癌土壤桿菌（A．tumefaciens），有3個(gè)變種［23］。菌體桿狀，單個(gè)或成對(duì)排列。不形成芽孢。革蘭氏陰性，以1～6根周毛運(yùn)動(dòng)。嚴(yán)格好氧，以氧分子為末端電子受體。最適生長(zhǎng)溫度為25～28℃。菌落通常凸起。全緣光滑，無(wú)色素至淺灰黃色。接觸酶陽(yáng)性，通常氧化酶和脲酶陽(yáng)性?？僧a(chǎn)生3－酮基乳糖?？蓮V泛利用碳水化合物、有機(jī)酸鹽和氨基酸作為碳源，但不能利用纖維素、淀粉、瓊脂糖和半乳糖等。未見(jiàn)種傳報(bào)道，多為土壤傳播。此屬細(xì)菌多可以引致植物細(xì)胞的自發(fā)增生而成為腫瘤細(xì)胞［23］。

1．4 細(xì)菌性冠腐和根腐綜合病

癥狀：細(xì)菌性冠腐和根腐綜合病可為害各個(gè)生長(zhǎng)期的苜蓿植株。該病初發(fā)生時(shí)，在種植地零散地出現(xiàn)。感病植株的一系列病變?yōu)?，黃化，褪綠，并表現(xiàn)為萎蔫狀，進(jìn)而萎蔫，壞死，植株矮化和葉子畸形。

病原：苜蓿細(xì)菌性冠腐和根腐綜合病的病原為綠黃假單胞菌 （P．viridiflava）。菌體桿狀，大小為（0．5～1．0）μm×（1．5～5．0）μm。革蘭氏陰性，極生鞭毛運(yùn)動(dòng)。嚴(yán)格需氧菌，進(jìn)行嚴(yán)格的呼吸型代謝，以氧為最終電子受體。5%蔗糖營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，菌落常黃色；在含酵母膏和甘油培養(yǎng)基上，菌落為橄欖綠到金黃色。有些菌株可產(chǎn)生藍(lán)色色素。氧化酶陰性?？梢岳镁剖猁}，丙酮酸酯和山梨醇；不能利用棉籽糖，延胡索酸酯戊二酸鹽和蔗糖。此菌在高濕和下雨條件下最為活躍，可隨雨流傳播，多為植物致病菌。

1．5 細(xì)菌性葉斑病和猝倒病

癥狀：細(xì)菌性葉斑病主要發(fā)生于葉片上。初為小而圓的水漬狀病斑、黃色、分散；后期呈不規(guī)則形，淡褐色。葉片背面水漬狀邊緣明顯。病部中心干枯呈紙狀，有發(fā)亮的淡黃至棕褐色半透明菌膜。此病害引起植株嚴(yán)重落葉，易被真菌病害病斑掩蓋。

癥狀：猝倒病主要發(fā)生于苜蓿生長(zhǎng)的苗期。幼苗大多從莖基部感病，初為水漬狀，并很快擴(kuò)展、溢縮變細(xì)如“線”樣，病部不變色或呈黃褐色，病勢(shì)發(fā)展迅速，在子葉仍為綠色、萎蔫前即從莖基部（或莖中部）倒伏而貼于床面。

病原：苜蓿細(xì)菌性葉斑和猝倒病的病原均為野油菜黃單胞菌苜蓿致病變種（X．campestrispv．a(chǎn)lfalfae）［16］。菌體桿狀，大小為（0．4～0．6）μm×（0．8～2．0）μm，單生，對(duì)生或呈短鏈狀。革蘭氏陰性，單極生鞭毛運(yùn)動(dòng)。嚴(yán)格需氧菌，進(jìn)行嚴(yán)格的呼吸型代謝，以氧為最終電子受體。營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，菌落常黃色，光滑呈奶油狀，類(lèi)粘蛋白或具粘性。其色素系具特色的溴化芳基多烯酶，一般稱之為黃單胞菌色素（Xanthomonadins）。沒(méi)有硝化作用或反硝化作用的發(fā)生。?？僧a(chǎn)生H2S，不產(chǎn)吲哚?？纱婊钣谥参锓N子。此屬細(xì)菌多為植物致病菌。

1．6 細(xì)菌性莖疫病

癥狀：細(xì)菌性莖疫常發(fā)生于早春直至第1個(gè)收獲期，通常在莖的第5節(jié)以下發(fā)病。發(fā)病初期水漬狀并且在葉莖連接點(diǎn)、葉中脈和葉柄處褪綠。病斑成線形，由淡褐色轉(zhuǎn)褐色并最終呈黑色。病斑逐漸向下發(fā)展，延至老根中。細(xì)菌滲出物可出現(xiàn)在葉表面，與病處接觸可使葉子褪色且死亡。發(fā)病莖稈薄而脆，普遍短于正常植株［14，19］。

病原：丁香假單胞菌薩氏致病變種（P．syringaepv．syringae）。菌體桿狀，大小為（0．7～1．2）μm×1．5 μm。沒(méi)有菌柄也沒(méi)有鞘。不產(chǎn)芽孢。革蘭氏陰性，以數(shù)根極毛運(yùn)動(dòng)。需氧，進(jìn)行嚴(yán)格的呼吸型代謝，以氧為最終電子受體。不產(chǎn)生黃單胞菌素。不能在酸性條件下生長(zhǎng)。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，圓形和白色的菌落緩慢生長(zhǎng)，直徑2～3mm。氧化酶陰性。從蔗糖產(chǎn)果聚糖，不能使果膠凹陷。不能積累聚－β－羥基丁酸鹽為儲(chǔ)藏物質(zhì)。不能反硝化，精氨酸雙水解酶陰性。能在甘露醇、甜菜堿、肌醇、山梨糖醇、胡蘆巴堿、奎尼酸鹽、赤蘚糖醇和L－乳酸鹽中生長(zhǎng)。不能在L－酒石酸鹽、氨基苯甲酸鹽和高絲氨酸中生長(zhǎng)。該屬細(xì)菌可存活于植物種子，存在多種致病變種，對(duì)多種植物致病。

1．7 細(xì)菌性萎蔫病

癥狀：此病明顯的癥狀是植株矮化，叢枝，頗似由病毒引致的“鬼帚病”。但在水肥等條件不良，牧草普遍長(zhǎng)勢(shì)欠佳時(shí)，該癥狀就不明顯。發(fā)病植株葉綠素含量下降［24］，故色澤淺淡，多呈淺綠，黃色，天氣炎熱時(shí)或呈淡褐色。病株葉片細(xì)小，卷縮。天氣干熱時(shí)，株頂萎垂、干枯，甚至全株枯萎。刈割后再生草的矮化尤其顯著。每刈之后，植株愈益纖弱。病株常在越冬時(shí)死亡。以致草地逐年稀疏，牧草甚或絕跡。

病株的根部和莖部的維管束發(fā)生病變。主根和側(cè)根的木質(zhì)部變?yōu)辄S色，橙色，褐色，有時(shí)還雜以深色斑點(diǎn)。病變?cè)跈M切面上極為明顯。此病所引致的木質(zhì)部變色，不限于根頸和主根上部，可一直延伸到根梢。與凍害引致的木質(zhì)部變色有所區(qū)別。病根表面有時(shí)出現(xiàn)棕紅色或褐色潰瘍狀病斑。由于根、莖維管束系統(tǒng)破壞，病株地上部分常部分或全部凋萎。

病原：密執(zhí)安詭異棍狀桿菌（C．michiganensesubsp．insidiosus）。菌體桿狀，末端圓形，單生或成對(duì)，但不成鏈狀。大小為（0．4～0．5）μm×（0．7～1．0）μm。無(wú)鞭毛，不運(yùn)動(dòng)。不產(chǎn)芽孢。革蘭氏陽(yáng)性。瓊脂培養(yǎng)基上的菌落圓形，扁平或稍隆起，光滑，具光澤，粘稠。在馬鈴薯上或馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上漸變?yōu)樗{(lán)色或淡紫色［24］。可發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖和半乳糖，但不產(chǎn)氣。不產(chǎn)生H2S和氨。不能還原硝酸鹽，緩慢水解淀粉。最適生長(zhǎng)溫度23℃，致死溫度51～52℃。此菌有很多菌系，毒力差異很大。可在種子和植物殘?bào)w中長(zhǎng)期存活并傳播。密執(zhí)安棍狀桿菌存在多個(gè)亞種，可致使多種農(nóng)作物萎蔫病。

1．8 矮化病

癥狀：該病最明顯的癥狀為植株矮化。病株常有藍(lán)綠色小葉和短小的莖。主根大小正常，但切開(kāi)后，維管束黃化，伴隨著暗色條狀死組織。在新感染的植株中黃化一般出現(xiàn)在皮下的一圈。病株矮化并最終死亡。

病原：苛求木桿菌（X．fastidiosa）。該菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件有嚴(yán)格要求。革蘭氏陰性，為木質(zhì)部棲息菌。菌體桿狀，單生，大小為（0．25～0．5）μm×（1．0～4．0）μm。不運(yùn)動(dòng)。需氧，進(jìn)行嚴(yán)格的呼吸型代謝，以氧為最終電子受體。菌落奶油色至白色。凸起呈墊狀，光滑，整個(gè)邊緣呈乳白光和臍狀凸起粗糙的具波紋狀的邊緣。氧化酶陰性，接觸酶陽(yáng)性。最適生長(zhǎng)溫度26～28℃，最適pH值6．5～6．9?？燎竽緱U菌在葡萄（Vitisvinifera）上可造成嚴(yán)重的Pierce’s病。該病原未見(jiàn)種傳報(bào)道。

2 病害分布及寄主范圍

苜蓿細(xì)菌性病害在世界多個(gè)國(guó)家不同程度的危害苜蓿的生產(chǎn)，并且伴隨苜蓿的各個(gè)不同生長(zhǎng)期。苜蓿芽腐爛病，猝倒病，莖疫病，葉斑病，冠癭病，冠腐和根腐綜合病，苜蓿矮化病以及在苜蓿3年以上種植區(qū)可以發(fā)生毀滅性危害的細(xì)菌性萎蔫病。所以，詳細(xì)了解苜蓿細(xì)菌性病害的分布有助于我們綜合評(píng)價(jià)引進(jìn)苜蓿品種和選擇苜蓿產(chǎn)地。苜蓿細(xì)菌性病害廣泛分布于世界各個(gè)苜蓿種植區(qū)（表1），主要集中在美洲，歐洲和亞洲。大部分病原菌最適的生長(zhǎng)條件一致，22～27℃，相對(duì)濕度100%等，但不同病害的病原對(duì)寄主生長(zhǎng)部位要求存在差異，如歐文氏菌屬的兩種菌寄生于苜蓿芽上，根癌土壤桿菌引起根部細(xì)胞增生，苛求木桿菌為木質(zhì)部棲息菌，對(duì)生境要求苛刻等，這可能與某些組織具有特殊的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。因此同一病原可能在不同作物上表現(xiàn)出不同的癥狀，也可能在不同地理環(huán)境的同一植物上表現(xiàn)出不同危害現(xiàn)象。陰性致病細(xì)菌的寄主范圍比較廣泛，而詭異密執(zhí)安棒狀桿菌寄主窄，目前僅見(jiàn)它侵染苜蓿。各致病菌的寄主范圍詳見(jiàn)表1。

表1 苜蓿細(xì)菌性病害的分布及其病原寄主范圍Table 1 Distribution and host range of alfalfa bacterial diseases

3 病原細(xì)菌常用鑒定方法

苜蓿細(xì)菌性病害病原的分類(lèi)結(jié)合了表型特征和遺傳學(xué)特征鑒定手段，如研究較深入的密執(zhí)安詭異棍狀桿菌（C．michiganensesubsp．insidiosus）［54］。表型是指由于基因與環(huán)境因素相互作用所引起的，在細(xì)胞、器官和整體水平上可檢測(cè)到和觀察到的特征。細(xì)菌的表型分類(lèi)依據(jù)主要為細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征和不同實(shí)驗(yàn)條件的生長(zhǎng)能力及代謝特征等，可區(qū)分不同的菌種，但不能區(qū)分不同的菌株［55］。遺傳型信息主要為菌體內(nèi)核酸（DNA和RNA），當(dāng)前較為常用的是rRNA測(cè)序，它是細(xì)菌分類(lèi)的系統(tǒng)發(fā)育框架之基礎(chǔ)。此技術(shù)同樣存在缺點(diǎn)，即同種rRNA操縱子是多拷貝的，不同拷貝間16SrRNA有0～5%的差異，不同菌株間亦有0～16%的差異，因此在評(píng)價(jià)結(jié)果時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎處理。應(yīng)用多相鑒定方法可使鑒定結(jié)果更為可靠，是現(xiàn)代細(xì)菌分類(lèi)中的主流。在此我們簡(jiǎn)要地列出了細(xì)菌分類(lèi)學(xué)中常用的分類(lèi)依據(jù)和特征（表2）。

表2 細(xì)菌分類(lèi)學(xué)中應(yīng)用的類(lèi)別和特征［56］Table 2 Categories and characters applied in bacterial systematics［56］

3．1 表型特征鑒定

細(xì)菌的表型分類(lèi)技術(shù)包括形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征、抗生素的敏感性、噬菌體分型、血清學(xué)分析、蛋白質(zhì)分析等，在細(xì)菌分類(lèi)中具有重要意義。形態(tài)學(xué)特征始終被用作細(xì)菌分類(lèi)和鑒定的重要依據(jù)之一，而且也往往是系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性的一個(gè)標(biāo)志。在細(xì)菌系統(tǒng)分類(lèi)中眾多傳統(tǒng)的生化、營(yíng)養(yǎng)和生理特征測(cè)試業(yè)已建立，例如氧化發(fā)酵［57］、細(xì)胞色素氧化酶［58－60］、接觸酶［61］、氨肽酶［62－63］和 KOH 測(cè)試［64－66］等試驗(yàn)。一般情況下這些試驗(yàn)是在固體或液體培養(yǎng)基中進(jìn)行的，耗時(shí)耗力，常常也難以標(biāo)準(zhǔn)化和詮釋［55］。但是值得強(qiáng)調(diào)的是傳統(tǒng)的這些測(cè)試存在重要意義，尤其是這些表型特征對(duì)于分類(lèi)單位的劃定具有重要作用。實(shí)際上，在現(xiàn)代細(xì)菌分類(lèi)中，任何能穩(wěn)定地反映細(xì)菌種類(lèi)特征的資料都有分類(lèi)學(xué)意義，都可以作為分類(lèi)鑒定的依據(jù)。在苜蓿細(xì)菌性病害病原的鑒定中形態(tài)學(xué)特征等表型特征仍然扮演著不可或缺的角色?，F(xiàn)將幾種苜蓿細(xì)菌性病害病原的表型鑒定特征列出，以饗植物病理工作者（表3）。

表3 幾種苜蓿細(xì)菌性病害病原鑒定特征（a）Table 3 Phenotypic characters of pathogens of alfalfa bacterial diseases（a）

續(xù)表3 Continued

3．2 16SrRNA序列分析

20世紀(jì)70年代初，Woese和Coworkers開(kāi)始將16SrRNA序列分析應(yīng)用于原核生物的系統(tǒng)發(fā)育［55］。由于16SrRNA在生物進(jìn)化過(guò)程中變異頻率較低，大小適中（約1．5kb），既含有保守序列又含可變序列，攜帶了足夠的遺傳信息，而且其序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)，因此是合適的系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)，已成為細(xì)菌分類(lèi)和鑒定的一個(gè)有力工具［54，68］。16SrRNA序列主要通過(guò)寡核苷酸編目、克隆序列的測(cè)定、反轉(zhuǎn)錄直接測(cè)序、對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測(cè)序等方法獲得后，用一些必要的計(jì)算機(jī)分析軟件將所得序列與基因數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行同源性比較，進(jìn)而繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［69－72］。16SrDNA序列分析鑒定方法已在苜蓿細(xì)菌性萎蔫病菌的研究中得到應(yīng)用［54，73］。

3．3 Biolog自動(dòng)鑒定系統(tǒng)

Biolog自動(dòng)快速微生物鑒定系統(tǒng)是1984年美國(guó)安普中心生產(chǎn)的，此系統(tǒng)的商品化開(kāi)創(chuàng)了細(xì)菌鑒定史上新的一頁(yè)。它的鑒定原理為微生物利用碳源進(jìn)行新陳代謝時(shí)，產(chǎn)生的酶能使顯色物質(zhì)（如TV：Tetrazolium Violet；INT：ρ－iodonitrotetrazolium Violet）發(fā)生顏色反應(yīng)；微生物利用碳源代謝不斷增殖，濁度也會(huì)發(fā)生改變；Biolog基于以上原理建立了每種微生物的特征代謝指紋數(shù)據(jù)，即與微生物種類(lèi)相對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，檢測(cè)時(shí)通過(guò)智能軟件將待鑒定微生物的碳源指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)參比，即可得出鑒定結(jié)果。它的核心技術(shù)為鑒定板和數(shù)據(jù)庫(kù)。革蘭氏陰性（GN）和革蘭氏陽(yáng)性（GP）鑒定板中含95種不同碳源、膠質(zhì)和四唑類(lèi)顯色物質(zhì)。根據(jù)2006年的數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，Biolog能鑒定革蘭氏陰性菌524種（106個(gè)屬）和革蘭氏陽(yáng)性菌351種（55個(gè)屬），包括幾乎全部人類(lèi)病原菌，190種動(dòng)、植物病原菌以及部分與環(huán)境有關(guān)的細(xì)菌等。Biolog技術(shù)具有數(shù)據(jù)庫(kù)容量大，種類(lèi)齊全；鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率高；鑒定周期短，最快4h出結(jié)果；操作簡(jiǎn)單，對(duì)操作者技術(shù)要求不高等特點(diǎn)。已在臨床、食品、植物病理、微生物生態(tài)、獸醫(yī)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［74－75］。

4 防治方法

4．1 植物檢疫

植物檢疫是一項(xiàng)傳統(tǒng)植物保護(hù)措施，苜蓿種帶病原物的檢疫，是病害防治的第一道卡，應(yīng)給予高度重視。植物檢疫其內(nèi)容涉及植物保護(hù)中的預(yù)防、杜絕或鏟除的各個(gè)方面，也是最有效和最經(jīng)濟(jì)，而且是一種具有法律強(qiáng)制性的一項(xiàng)具體措施。細(xì)菌性萎蔫病是苜蓿的一種毀滅性病害，在美國(guó)、加拿大、澳大利亞、新西蘭和日本等世界各地均有發(fā)生。苜蓿細(xì)菌性萎蔫病可以隨種子和植物殘?bào)w傳播，是我國(guó)出入境進(jìn)出口植物檢疫檢驗(yàn)病害。菊歐文氏菌在菊花上造成的菊基腐病亦是我國(guó)重要檢疫性病害之一。本文綜述的苜蓿細(xì)菌性病害，希望能在某一側(cè)面為國(guó)內(nèi)苜蓿細(xì)菌病害的檢疫工作提供有益參考。

4．2 利用抗病或耐病品種

抗病或耐病品種的利用在牧草病害管理中是經(jīng)濟(jì)且有效的措施，其在牧草病害可持續(xù)管理體系中居于核心與主導(dǎo)地位［3］。培育抗病品種，更是防治苜蓿細(xì)菌性病害的主要方法，如耐寒品種可減少霜害，從而減少侵染率進(jìn)而降低細(xì)菌性莖疫病發(fā)生；維管束數(shù)目較少，導(dǎo)管較短，皮層較厚的苜蓿品種較抗細(xì)菌性萎蔫病。

4．3 農(nóng)業(yè)防治

細(xì)菌的繁殖與水分有著密切關(guān)系，水分是細(xì)菌流動(dòng)傳播的載體亦是菌體大量繁殖的供體。苜蓿苗期細(xì)菌性病害的防治應(yīng)注意采獲種子的前期晾曬，注重種子的儲(chǔ)存環(huán)境，陰涼通風(fēng)不利于細(xì)菌的滋生，注重保潔，用0．5%的次氯酸鈉或次氯酸鈣溶液浸泡2h有助防治苜蓿芽細(xì)菌腐爛病。合理的田間管理措施亦能有效防止病害侵染和流行傳播。比如：于春季播種能有效地防治細(xì)菌性葉斑病，在霜凍期后收獲或刈割，可減輕細(xì)菌性莖疫病侵染；提高土壤肥力，尤其是增加磷鉀肥，可以增加苜蓿對(duì)此病的抗性，使損失減輕；注意地下害蟲(chóng)的防治；刈割活動(dòng)，應(yīng)在天氣干燥，牧草表面無(wú)液態(tài)水時(shí)進(jìn)行；新播草地應(yīng)遠(yuǎn)離老齡草地，并且安排在老齡草地的上游或地勢(shì)較高；病情較重的草地，應(yīng)翻耕輪作；控制禾本科雜草。

4．4 生物防治

生物防治即利用自然界中生物間的“相克”作用，從而達(dá)到有害生物的防治［76］。南志標(biāo)［3］指出抗病品種的利用和草地的合理放牧均可屬于廣義的生物防治范疇。苜蓿細(xì)菌性病害的工作在國(guó)內(nèi)開(kāi)展還較為有限，因此相應(yīng)的生物防治的研究工作近乎空白。毫無(wú)疑問(wèn)，在生態(tài)環(huán)境日益惡化的背景下，牧草在生態(tài)環(huán)境保護(hù)及治理方面的作用將日益凸顯。眾所周知，化學(xué)防治中農(nóng)藥直接作用于牧草而殘留，污染草地和整個(gè)牧草生產(chǎn)，通過(guò)食物鏈最終影響人類(lèi)健康。由此更加顯現(xiàn)出生物防治在苜蓿細(xì)菌性病害防治中具有光明的前景，應(yīng)是我國(guó)亟待加強(qiáng)的研究領(lǐng)域之一。

總而言之，關(guān)于苜蓿細(xì)菌性病害的防治應(yīng)以種帶病原物檢疫，預(yù)防為主；重視生態(tài)環(huán)境的保護(hù)，以發(fā)展生物防治為輔；培育抗病品種，加強(qiáng)種子采后等綜合管理措施，從而達(dá)到提高苜蓿生產(chǎn)力。

5 展望

苜蓿細(xì)菌性病害與真菌性病害及其他類(lèi)病害的研究存在較大差異，我國(guó)在此方面的研究工作也遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于其他苜蓿種植國(guó)家。在9種已知的苜蓿細(xì)菌性病害中，對(duì)于它們的研究程度是與病害的危害程度呈正比的，尤其對(duì)于苜蓿細(xì)菌性萎蔫病的研究較其他深入。但是病害的危害程度是會(huì)隨寄主、地域或特發(fā)的氣候條件等而轉(zhuǎn)變的。所以我們不能就因某些病害經(jīng)濟(jì)危害程度較輕，而對(duì)其不予足夠重視。地球上90%左右的食用作物是以種子繁殖的，種帶病原是很多農(nóng)作物病害的重要初侵染源之一，是引起作物在田間和在貯藏期發(fā)病的禍根。種子攜帶并傳播病害是很多地區(qū)發(fā)生新病害的原因。理論上任何植物病原細(xì)菌都有可能由種子傳播。細(xì)菌性病害的傳播形式多樣，種子由于其豐富的營(yíng)養(yǎng)條件及理想的含水量，使其成為病原寄生和再傳播最為理想及隱蔽的媒介。Neergaard［77］報(bào)道，細(xì)菌在植物種子表皮可存活2～3年不等，但是它們卻可在種子內(nèi)長(zhǎng)久的存活。Nemeth等［13］指出，細(xì)菌可隨苜蓿種子對(duì)原本無(wú)病區(qū)域進(jìn)行生物入侵。據(jù)世界貿(mào)易圖集統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，我國(guó)自2007年從外進(jìn)口苜蓿2160t，并逐年劇烈增長(zhǎng)，直至2010年上半年進(jìn)口苜蓿量達(dá)95079t。一方面，世界貿(mào)易和世界氣候變化全球化的同時(shí)，生物入侵對(duì)各國(guó)都是一個(gè)嚴(yán)峻的考驗(yàn)，苜蓿上細(xì)菌性病原的入侵可對(duì)苜蓿生產(chǎn)造成不可估量的重大經(jīng)濟(jì)損失，如苜蓿細(xì)菌性萎蔫病等；另一方面，目前關(guān)于苜蓿細(xì)菌性病害的調(diào)查及研究工作在我國(guó)近乎空白，一旦一些不為我們所熟悉的細(xì)菌性病害流行爆發(fā)，將對(duì)苜蓿的生產(chǎn)是一個(gè)嚴(yán)峻的考驗(yàn)。所以，如何用最簡(jiǎn)便的方法快速準(zhǔn)確的識(shí)別和鑒定出病害及其病原，是植物病理工作者及所有檢疫人員共同追求的目標(biāo)。一方面，一些先進(jìn)技術(shù)的誕生，為我們提供了解決這些問(wèn)題的不同手段；另一方面，全面客觀的了解一種病害及其病原特征，卻不是只能靠某些先進(jìn)技術(shù)就能解決的簡(jiǎn)單問(wèn)題。所以在病害和病原的識(shí)別和鑒定中，結(jié)合病理工作者積累的田間經(jīng)驗(yàn)和室內(nèi)分子鑒定，自動(dòng)數(shù)值鑒定（Biolog）和傳統(tǒng)的表型特征鑒定等方法，是細(xì)菌病害及其病原鑒定方法呈現(xiàn)多樣化形勢(shì)下的趨勢(shì)。綜上所述，首先詳盡了解苜蓿存在的細(xì)菌性病害，對(duì)我國(guó)苜蓿的進(jìn)口將是一個(gè)防患于未然的有效策略；其次苜蓿種帶細(xì)菌區(qū)系也是衡量種子健康的重要指標(biāo)之一，隨著種子進(jìn)口貿(mào)易量的增加，我們有必要對(duì)苜蓿種帶細(xì)菌進(jìn)行詳盡的探明；最后隨著苜蓿種植量在國(guó)內(nèi)的穩(wěn)步提升，開(kāi)展全面客觀的存在于我國(guó)的苜蓿細(xì)菌性病害調(diào)查工作勢(shì)在必行。

苜蓿品質(zhì)優(yōu)良、適口性好、飼用形式多樣、飼用價(jià)值高和良好的生態(tài)效應(yīng)，被冠以“牧草之王”的美譽(yù)。苜蓿除可以作為牧草外，近年來(lái)隨著人們對(duì)苜蓿營(yíng)養(yǎng)的不斷認(rèn)識(shí)，苜蓿芽正在作為一種食品被人們所接受。隨之而來(lái)的苜蓿食源性中毒事件也屢有發(fā)生。民眾食物安全意識(shí)的提高，將人們的眼光聚焦于食源性致病菌的最新動(dòng)態(tài)。因此植物上人體致病細(xì)菌的研究將是病理研究方向的熱點(diǎn)之一，尤其是苜蓿上的人體致病細(xì)菌。如桃色歐文氏菌不僅可以引起苜蓿芽萎蔫病，還可以引起人類(lèi)尿道感染［78］，而且它是一種苜蓿種傳病害，但是對(duì)于它是否可引起食源性中毒還未可知？我國(guó)草原面積遼闊，草原類(lèi)型豐富，農(nóng)牧交錯(cuò)帶明顯和管理程度參差不齊等因素，使得以苜蓿為主等牧草病害在時(shí)間與空間分布上呈現(xiàn)差異化和病害種類(lèi)上呈現(xiàn)多樣化。綜合考慮，我們急需開(kāi)展以下幾個(gè)方面的工作：1）分離和鑒定不同苜蓿品種種帶細(xì)菌，探明它們的致病性或有益作用；2）全國(guó)范圍內(nèi)調(diào)查天然草地與管理型草地和農(nóng)牧交錯(cuò)帶草原與農(nóng)田種植草原苜蓿細(xì)菌性病害的種類(lèi)及危害程度，分析它們的相互關(guān)系；3）全國(guó)范圍內(nèi)調(diào)查苜蓿細(xì)菌性病害的種類(lèi)及其分布，初步建立苜蓿細(xì)菌性病害病原資源庫(kù)；4）探索對(duì)苜蓿細(xì)菌性病害行之有效的生物等防治手段。

致謝：在論文寫(xiě)作過(guò)程中承蒙甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)的陳秀蓉教授和楊成德副教授以及蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院副教授段廷玉給予的建設(shè)性意見(jiàn)，謹(jǐn)此一并致謝。

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