DNA損傷檢驗點(diǎn)ATM—chk2通路影響衰老的作用機(jī)制分析

[摘要] 目的 分析DNA損傷檢驗點(diǎn)ATM-chk2通路對影響衰老的作用機(jī)制。 方法 選擇SD大鼠4個月齡、12個月齡、20個月齡和28個月齡各10只，分別取4個月齡、12個月齡、20個月齡和28個月齡大鼠的骨髓組織進(jìn)行ATM-chk2通路的觀察，并對結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果 4個月齡、12個月齡、20個月齡和28個月齡SD大鼠的ATM基因表達(dá)隨著月齡增加，呈逐漸下降趨勢，不同月齡大鼠間比較，差異具有顯著性（P < 0.05）；ATM-chk2通路基因蛋白表達(dá)呈逐漸上升趨勢，組間比較差異具有顯著性（P < 0.05）。 結(jié)論 ATM基因表達(dá)及ATM-chk2通路基因蛋白表達(dá)水平和大鼠月齡直接相關(guān)，年齡越大ATM基因表達(dá)日漸降低，ATM-chk2通路基因蛋白表達(dá)呈逐漸上升趨勢。

[關(guān)鍵詞] DNA損傷檢驗點(diǎn)；ATM-chk2通路；衰老

[中圖分類號] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）15-0037-02

本研究在前期工作基礎(chǔ)上觀察老年小鼠DNA損傷檢驗點(diǎn)ATM-chk2通路的基因表達(dá)變化及淫羊藿苷提取液的干預(yù)作用，并進(jìn)一步通過實驗觀察利用RNA干擾技術(shù)抑制ATM-chk2通路后對細(xì)胞衰老的影響及淫羊藿苷的干預(yù)作用是否發(fā)生變化。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 實驗動物 采用SD大鼠，由復(fù)旦大學(xué)科學(xué)部實驗室提供，分別隨機(jī)選擇4個月齡、12個月齡、20個月齡和28個月齡各10只。4組SD大鼠的體重、身長、活躍情況均無顯著性差異，具有可比性。

1.1.2 所用試劑 ATM，cdc25c，cdc2，cdc25A，c-Abl 均為SANTA 公司提供，Cdk2為Biolegend公司生產(chǎn)。

1.2方法

分別取4個月齡、12個月齡、20個月齡和28個月齡大鼠的骨髓組織進(jìn)行ATM-chk2通路的觀察，并對其結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.1 ATM-chk2通路的研究 ①骨髓組織的制備：分別將4組大鼠脫頸椎處死。并采用75%的乙醇進(jìn)行消毒，置于方盤內(nèi)，撥開大鼠的大腿皮膚，分離肌肉，剪開雙側(cè)股骨頸，采用pH值為7.2 的PBS液沖洗，置于已經(jīng)滅菌的EP管內(nèi)。②骨髓細(xì)胞涂片：采用SP免疫組化法，顯色劑為DAB。一抗?jié)舛葹?∶100。采集取骨髓細(xì)胞進(jìn)行涂片，采用丙酮做固定液，固定15 min。再經(jīng)二次蒸餾水進(jìn)行清洗，采用pH值為7.2的PBS液少量多次緩緩清洗，再經(jīng)濃度為3%的雙氧水浸泡以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。在采用二次蒸餾水、pH=7.2值的PBS液重復(fù)上次的清洗操作。再采用正常羊血清工作液37℃封閉10 min，滴加一抗，于4℃冰箱中過夜孵育。第2日滴加二抗，于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，經(jīng)PBS溶液沖洗3次，每次5 min；沖洗后加DAB顯色液，再用PBS溶液沖洗3次，每次5 min；滴加蘇木素染色10 s，待流水返藍(lán)，進(jìn)行常規(guī)脫水，透明，干燥，封片。

1.3 觀察指標(biāo)

在顯微鏡下對陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)并統(tǒng)計陽性細(xì)胞率。于100倍光學(xué)顯微鏡下觀察五個視野中的蛋白陽性表達(dá)率，取均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別大鼠的ATM基因表達(dá)情況比較

4個月齡、12個月齡、20個月齡和28個月齡SD大鼠的ATM基因表達(dá)隨著月齡增加，呈逐漸下降趨勢，不同月齡大鼠間行方差分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 不同組別大鼠的ATM-chk2通路基因蛋白表達(dá)情況比較

4個月齡、12個月齡、20個月齡和28個月齡SD大鼠的ATM-chk2通路基因蛋白呈逐漸上升趨勢，組間行方差齊性檢驗，差異具有顯著性（P < 0.05）。

3討論

衰老，一般是指生命周期中隨增齡而發(fā)生的、漸進(jìn)的、受多種因素影響的、全身復(fù)雜的形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理功能不可逆的退行性變化[2]。世界性的人口老齡化趨勢，使如何延緩衰老、提高老年人生存質(zhì)量不僅有醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等方面的意義[3]，同時也有更為廣泛的社會意義。因此延緩衰老、防治腦老化的研究成為目前老年醫(yī)學(xué)界主要課題之一，正日益引起醫(yī)學(xué)界的廣泛重視[4]。衰老是機(jī)體經(jīng)長期發(fā)展，漸進(jìn)累積而成，其為機(jī)體最復(fù)雜的生物過程之一[5]。機(jī)體衰老時，其各種組織、系統(tǒng)、不同層次都發(fā)生相應(yīng)的變化，因此從不同層面去研究衰老的過程，從而揭示衰老的規(guī)律具有更為重要的價值[6]。

DNA損傷造成的基因組不穩(wěn)定性是衰老發(fā)生過程中的核心環(huán)節(jié)[7]。以ATM-chk2通路為主的DNA損傷檢驗點(diǎn)是調(diào)控DNA損傷修復(fù)最為重要的關(guān)卡，與衰老的發(fā)生關(guān)系密切[8]。我們前期研究從細(xì)胞水平、低等動物、哺乳動物三個層次發(fā)現(xiàn)ATM-chk2通路及其基因蛋白表達(dá)對衰老存在一定的影響。同時前期利用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)老年小鼠DNA損傷反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，但ATM基因表達(dá)下調(diào)[9]。細(xì)胞周期DNA損傷的檢測主要依賴于細(xì)胞周期監(jiān)測點(diǎn)信號通路來完成，其中毛細(xì)血管擴(kuò)張共濟(jì)失調(diào)突變基因（ATM基因）及其編碼的產(chǎn)物蛋白激酶在該通路中起著重要的作用[10，11]。ATM基因通路是DNA修復(fù)中十分重要的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[12]。ATR-chk2通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑：DNA損傷誘導(dǎo)ATR激活下游chk1，chk1主要磷酸化Cdc25C[13]，通過Cdc2調(diào)控G2/M期；也介入ATM-chk2下游通路，磷酸化Cdc25A，參與S期損傷檢測調(diào)控[14，15]。

本研究資料中，4個月齡、12個月齡、20個月齡和28個月齡SD大鼠的ATM基因表達(dá)隨著月齡增加，呈逐漸下降趨勢，不同月齡大鼠間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；ATM-chk2通路基因表達(dá)呈逐漸上升趨勢，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

綜上所述，ATM基因表達(dá)及ATM-chk2通路基因蛋白表達(dá)水平與大鼠月齡直接相關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王學(xué)波，李建遠(yuǎn).線粒體DNA突變與衰老[J]. 中外醫(yī)學(xué)研究，2011， 9（18）：160-161.

[2] ALRS，Harding SM，Law C，et al. Phosphoforms and ATM and 53BP1 at sites of exogenous DNA damage[J]. Radaiat Res，2011，175（5）：588-589.

[3] 曾慶岳，王云山. 淫羊藿藥理作用研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，31（4）：462-465.

[4] 賈亮亮，袁丁，王洪武，等. 淫羊藿苷藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，10（20）：3976-3979.

[5] 汪海東，夏世金，陳頌春，等. 淫羊藿苷經(jīng)NF-κB信號通路干預(yù)大鼠免疫衰老的作用及機(jī)制[J]. 中國老年學(xué)雜志，2010，30（20）：2938-2941.

[6] 吳滿剛，賀曉麗，強(qiáng)桂芬，等. 淫羊藿苷對快速老化小鼠SAMP8腦線粒體的保護(hù)作用[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2010，15（7）：721-725.

[7] 劉東華，吳滿剛，畢明剛，等. 淫羊藿苷對去卵巢快速老化小鼠（SAMP8）學(xué)習(xí)記憶及皮層氧化應(yīng)激的影響[J]. 軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報，2010，31（6）：580-583.

[8] 劉小雨，沈自尹，王琦，等. 淫羊藿總黃酮（iF）對老齡大鼠Thl、Th2、Th3細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國免疫學(xué)雜志，2005，21（11）：842-846.

[9] 陳作舟. 篩選機(jī)制與衰老的DNA損傷假說[J]. 遺傳，2001，23（6）：559-563.

[10] 楊茂林，孟思進(jìn). 線粒體氧化損傷在衰老發(fā)生機(jī)制中的作用[J]. 醫(yī)學(xué)綜述，2010，16（9）：1297-1300.

[11] Wahl GM，Cart AM. The evolution of diverse biological responses to DNA damage：insights from yeast and p53[J]. Nature Cell Biol，2001，3fI2）：E277-E286.

[12] Zhu Rongrong，Wang Shilong，Sun Xiaoyu，et al. The protection effect of β-CD on DNA damage induced by ultrafine TiO2[J]. 中國科學(xué)B輯（英文版），2007，50（2）：272-275.

[13] Hui Yu. Typical cell signaling response to ionizing radiation：DNA Damage and Extranuclear Damage[J].2012，24（2）：83-89.

[14] Ming TIAN，Yongdong FENG，Jiang MIN，et al. DNA damage response in resting and proliferating peripheral blood lymphocytes treated by camptothecin or X-ray[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)）（英德文版），2011，31（2）：147-153.

[15] HUANG Yuwen，JIAN Le，ZHANG Meibian，et al. An investigation of oxidative DNA damage in pharmacy technicians exposed to antineoplastic drugs in two Chinese hospitals using the urinary 8-OHdG assay[J]. 生物醫(yī)學(xué)與環(huán)境科學(xué)（英文版），2012，25（1）：109-116.

（收稿日期：2013-02-25）