SphK1突變抑制高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞纖維連接蛋白過度表達(dá)的研究

[提要] 目的 研究鞘氨醇激酶-1（SphK1）突變是否抑制了高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中纖維連接蛋白（FN）的過度表達(dá)。 方法 采用Western blot檢測FN的表達(dá)。 結(jié)果 系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染了SphK1突變質(zhì)粒后可消除高糖誘導(dǎo)的FN上調(diào)效應(yīng)。 結(jié)論 本研究結(jié)果證明了SphK1在高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞FN表達(dá)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

[關(guān)鍵詞] SphK1；纖維連接蛋白；系膜細(xì)胞

[中圖分類號] R587.2；R692.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）15-0010-02

系膜細(xì)胞（Mesangial cell，MC）是腎小球的主要功能細(xì)胞，無論在腎臟的生理功能還是病理變化中均發(fā)揮著重要的作用；現(xiàn)已認(rèn)為MC主要參與了糖尿病腎病腎小球硬化損傷過程。FN是由系膜細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，在糖尿病狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞FN等細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，導(dǎo)致腎小球硬化、促進(jìn)糖尿病腎病的病變進(jìn)程[1]。鞘氨醇激酶（sphingosine kinase， SphK）是催化S1P生成的關(guān)鍵限速酶[2]。我們前期研究表明：用四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型12周后，模型組小鼠在腎小球結(jié)構(gòu)異常、腎功能降低的基礎(chǔ)上，SphK1蛋白表達(dá)與活性較正常組相比明顯升高；免疫組化結(jié)果顯示，小鼠腎組織的SphK1主要表達(dá)于腎小球細(xì)胞，而模型組與正常組相比顯著升高[3]，提示在糖尿病狀態(tài)下SphK1的激活可能參與了糖尿病腎病的病變進(jìn)程。本研究重點(diǎn)觀察SphK1對細(xì)胞外基質(zhì)主要成分-FN的調(diào)節(jié)作用，探討糖尿病狀態(tài)下高糖激活的SphK1對系膜細(xì)胞FN生成的具體分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 腎小球系膜細(xì)胞原代培養(yǎng)

采用逐級過篩法從SD大鼠的腎臟分離得到腎小球，用完全培養(yǎng)基（DMEM+20%胎牛血清+胰島素 0.66 U/mL+ 2 mM谷氨酰胺+青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL）約2滴，用吸管重懸腎小球，加入塑料培養(yǎng)瓶中，向各方向輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，使含腎小球的細(xì)胞懸液均勻分布于瓶底，待細(xì)胞懸液近干時(shí)，然后迅速倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（使培養(yǎng)面朝上），加入約5 mL完全培養(yǎng)液，放入CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，4 h后，再輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來。待原代腎小球系膜細(xì)胞長滿瓶底后，吸棄培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基，用PBS沖洗培養(yǎng)瓶。加入0.25%胰蛋白酶消化約1～3 min，鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞突起回縮，細(xì)胞間隙增大，或輕輕振動后絕大部分細(xì)胞懸浮、漂移，立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化，于1000 rpm離心5 min，傳代培養(yǎng)基懸浮GMC至所需濃度，按1∶2比例傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)采用第3代到第15代之間的細(xì)胞。

1.2 質(zhì)粒和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

空載體（Vector），突變型質(zhì)粒（SphKG82D）由澳大利亞Dr. Pu Xia贈送。按照產(chǎn)品說明書采用Lipofectamine 2000（Invitrogen）轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞72 h后收集細(xì)胞。

1.3 Western blot

細(xì)胞經(jīng)裂解提取蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF。采用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，將一抗、二抗孵育后，采用增強(qiáng)型的化學(xué)發(fā)光液檢測條帶信號。膜重孵鼠單抗 α-tubulin作為內(nèi)參對照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)值采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析結(jié)合Bonferroni校正分析多組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

SphK1突變抑制了高糖誘導(dǎo)MC的FN表達(dá)，MC分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒Vector和突變型質(zhì)粒SphKG82D。結(jié)果表明，高糖能明顯上調(diào)FN的表達(dá)；轉(zhuǎn)染了SphKG82D質(zhì)粒后顯著抑制了高糖誘導(dǎo)的FN表達(dá)，而轉(zhuǎn)染Vector質(zhì)粒無此效應(yīng)，證明SphK1參與了高糖誘導(dǎo)的FN表達(dá)。

3 討論

系膜細(xì)胞是腎臟的主要功能細(xì)胞，糖尿病狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞FN等細(xì)胞外基質(zhì)成分的積聚是導(dǎo)致腎小球硬化、促進(jìn)糖尿病腎病病變形成的重要特征。因此，我們采用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞S1P信號通路的激活與細(xì)胞外基質(zhì)成分FN生成的關(guān)聯(lián)性，以明確高糖激活的S1P信號通路參與糖尿病腎病病理進(jìn)程的作用機(jī)制。

SphK1是催化S1P生成的關(guān)鍵酶[2，4，5]。研究表明：長期高血糖、AGEs、氧化應(yīng)激等可激活SphK1，進(jìn)而導(dǎo)致S1P的生成增加[6-9]。以往研究表明S1P在腎小球系膜疾病中起著重要作用[10-12]。外源性S1P可顯著促進(jìn)GMC增殖[10-12]，導(dǎo)致腎臟疾病的發(fā)生。

近年來，SphK1-S1P信號通路與包括糖尿病腎病在內(nèi)的糖尿病性血管并發(fā)癥的關(guān)系日益受到關(guān)注，成為相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。慢性高血糖現(xiàn)被認(rèn)為是糖尿病微血管及大血管病變的主要致病因素；血管內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致糖尿病慢性血管病變的起始環(huán)節(jié)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞SphK1的活化，參與了內(nèi)皮損傷過程。同樣在高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中SphK活性也有顯著增加，采用siRNA技術(shù)證明高糖主要激活SphK16。高血糖狀態(tài)下形成的AGEs現(xiàn)已證明是外周微血管病變的主要致病因素之一，導(dǎo)致糖尿病腎病和終末期腎衰竭。Geoffroy等用AGEs處理GMC，發(fā)現(xiàn)當(dāng)AGEs低濃度時(shí)，神經(jīng)酰胺酶和鞘氨醇激酶活性明顯升高，導(dǎo)致S1P積聚，誘使GMC增殖。Geoffroy隨后觀察了STZ誘導(dǎo)小鼠4 d后腎臟中SphK1活性和S1P含量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著腎小球系膜細(xì)胞輕度增殖，腎臟中SphK1活性和S1P均顯著增加，提示SphK1-S1P信號通路可能參與了糖尿病腎小球增殖過程[8，9]。

本研究發(fā)現(xiàn)：在正常糖培養(yǎng)情況下，MC經(jīng)過高糖培養(yǎng)后，F(xiàn)N的表達(dá)顯著升高，而轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒SphKG82D的MC，幾乎完全抵消高糖誘導(dǎo)的MC中FN上調(diào)效應(yīng)，提示高糖誘導(dǎo)的FN過度表達(dá)需要SphK1的參與調(diào)節(jié)，為探尋將SphK1-S1P信號通路作為抗糖尿病腎病的可能作用靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2013-04-03）