漢黃芩素對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、凋亡、Survivin及Caspase—3表達(dá)的影響

[摘要] 目的 探討漢黃芩素在人膠質(zhì)瘤患者中對(duì)U251細(xì)胞的增殖與凋亡及對(duì)存活素（Survivin）及半胱天冬酶-3（Caspase-3）表達(dá)的影響。 方法 不同濃度漢黃芩素作用于人膠質(zhì)瘤96株U251細(xì)胞，并與使用替莫唑胺（TMZ）的陽(yáng)性對(duì)照組（48株）及未給予任何藥物的空白對(duì)照組（48株）對(duì)比細(xì)胞增殖抑制率、細(xì)胞凋亡率及Survivin和Caspase-3蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。 結(jié)果 各濃度漢黃芩素對(duì)細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于空白對(duì)照組，且隨藥物濃度及作用時(shí)間的增加呈現(xiàn)出顯著增高趨勢(shì)（P < 0.05），漢黃芩素組細(xì)胞凋亡率顯著高于TMZ組（P < 0.01），TMZ組顯著高于空白對(duì)照組（P < 0.01），在漢黃芩素組內(nèi)，細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度增加顯著增加（P < 0.05）；漢黃芩素組Survivin表達(dá)強(qiáng)度顯著低于TMZ及空白對(duì)照組（P < 0.01）；兩藥物組Caspase-3表達(dá)強(qiáng)度顯著高于空白對(duì)照組（P < 0.01）。 結(jié)論 漢黃芩素可通過(guò)調(diào)節(jié)Survivin、Caspase-3蛋白的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞起到誘導(dǎo)凋亡的作用。

[關(guān)鍵詞] 漢黃芩素；膠質(zhì)瘤；U251；增殖；凋亡；Survivin；Caspase-3

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）15-0005-03

膠質(zhì)瘤是最為常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，膠質(zhì)瘤占腦腫瘤總數(shù)的50%～55%。該腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難度較大，生物學(xué)特性復(fù)雜，放化療不敏感，療效差，預(yù)后差[1]。近年來(lái)，隨著對(duì)膠質(zhì)瘤研究的深入，特別是對(duì)中藥或中藥提取活性單成分的研究均表明其具有多種抗腫瘤活性，且副作用少。漢黃芩素是傳統(tǒng)中藥黃芩及半枝蓮的活性提取物，其抗腫瘤活性近年來(lái)受到廣泛關(guān)注[2]。筆者使用漢黃芩素溶液處理人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，以探討其對(duì)U251細(xì)胞增殖與凋亡及對(duì)Survivin及Caspase-3表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供的人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞192株，Gibco BRL公司提供的RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清（FBS）、胰酶-EDTA混合液、PBS緩沖液（1×），北京索萊寶科技有限公司提供的青鏈霉素混合液（100×），Abcam公司提供的β-actin小鼠單克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司提供的Survivin兔多克隆抗體、CCK8試劑盒，Millipore公司提供的PVDF膜，美國(guó)Pierce公司提供的BCA蛋白測(cè)定試劑盒，漢黃芩素由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供（批號(hào)：111514-200403），替莫唑胺膠囊（TMZ）由江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞復(fù)蘇并接種于含10%新生胎牛血清和含1%鏈霉素、青霉素的RPMI 1640（1∶10混合）完全培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)孵育，以0.25%胰蛋白酶消化，待細(xì)胞貼壁覆蓋80%～90%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。漢黃芩素及TMZ用DMSO溶解為100 mmol/L的母液，儲(chǔ)存于4℃恒溫箱內(nèi)，使用前進(jìn)行稀釋。U251細(xì)胞株分組：漢黃芩素組96株，TMZ組48株，空白對(duì)照組48株。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率、Survivin以及Caspase-3表達(dá)情況檢測(cè) CCK8法測(cè)定計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率，Western blot測(cè)定Survivin及Caspase-3蛋白的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，均數(shù)比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制率比較

漢黃芩素各濃度對(duì)細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于空白對(duì)照組，且抑制率隨著藥物濃度及作用時(shí)間的增加呈現(xiàn)出顯著增高趨勢(shì)[t12.5μmol/L=2.769 6（24～48 h），2.544 1（48～72 h），P12.5μmol/L=0.008 1（24～48 h），0.014 4（48～72h）；t25μmol/L=2.161 1（24～48 h），2.128 2（48～72 h），P25μmol/L=0.035 9（24～48 h），0.038 7（48～72 h）；t50μmol/L=2.068 7（24～48 h），2.071 1（48～72 h），P50μmol/L=0.031 7（24～48 h），0.044 0（48～72 h）；t100μmol/L=8.196 3（24～48 h），4.673 6（48～72 h），P100μmol/L=0.000 0（24～48 h），0.000 0（48～72 h）]。100 μmol/L漢黃芩素組的細(xì)胞增殖抑制率與TMZ組大致相當(dāng)，僅48h具有顯著差異（t = 2.1834，P < 0.05）；漢黃芩素組同一時(shí)間內(nèi)抑制率隨著藥物濃度的增加而呈現(xiàn)出顯著增高趨勢(shì)[t24h=7.635 5（12.5～25 μmol/L），6.3687（25～50） μmol/L，6.664 9（50～100） μmol/L，P24h=0.000 0（12.5～25） μmol/L，0.000 0（25～50） μmol/L，0.000 0（50～100） μmol/L；t48h=6.682 8（12.5～25） μmol/L，3.753 4（25～50） μmol/L，6.855 5（50～100） μmol/L，P48h=0.000 0（12.5～25） μmol/L，0.0005（25～50） μmol/L，0.0000（50～100） μmol/L；t72h=7.389 5（12.5～25） μmol/L，5.034（25～50） μmol/L，10.592 8（50～100） μmol/L，P72h=0.000 0（12.5～25） μmol/L，0.000 0（25～50） μmol/L，0.000 0（50～100） μmol/L]。

2.2 細(xì)胞凋亡率比較

漢黃芩素組及TMZ組細(xì)胞凋亡率均顯著高于空白對(duì)照組（P < 0.01）；同濃度的漢黃芩素造成的凋亡率顯著高于TMZ組（P < 0.01）；在漢黃芩素組內(nèi)，細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度增加而呈現(xiàn)出顯著差異（P < 0.05）。

2.3 藥物作用48 h Survivin表達(dá)情況比較

兩組藥物處理組Survivin蛋白表達(dá)強(qiáng)度均顯著低于空白對(duì)照組（P < 0.01），且漢黃芩素組顯著低于TMZ組（t =8.365 0，P = 0.000 0）。

2.4 藥物作用48 h Caspase-3表達(dá)情況比較

漢黃芩素組及TMZ組Caspase-3蛋白表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于空白對(duì)照組（P < 0.01）；TMZ組與漢黃芩素組Caspase-3蛋白表達(dá)強(qiáng)度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 0.864 7，P =0.388 6）。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是最為常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，其治療一直是醫(yī)學(xué)界的難題。膠質(zhì)瘤因其生物學(xué)特性及病理生理特點(diǎn)均較為復(fù)雜，且呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與周圍正常腦組織界限不明確，從而對(duì)該病的手術(shù)切除造成極大困難，本病對(duì)放射治療敏感性較低，療效較差，而化療雖然能夠起到一定作用，可有效殺滅腫瘤細(xì)胞，但同時(shí)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞的毒性作用也較為明顯，權(quán)衡利弊，獲益較少[3]。該病惡性程度較高，進(jìn)展迅速，預(yù)后不良，且具有較高的復(fù)發(fā)率和死亡率，因此，新型藥物的研發(fā)迫在眉睫。人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株與人實(shí)質(zhì)性腫瘤性質(zhì)相似，是研究膠質(zhì)瘤的常用細(xì)胞株。通常細(xì)胞凋亡或細(xì)胞程序性死亡是一個(gè)正常的生理過(guò)程，可以消除不必要的細(xì)胞，維護(hù)組織的動(dòng)態(tài)平衡。如果能夠?qū)?xì)胞增殖與凋亡之間的平衡進(jìn)行調(diào)節(jié)，則可對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)進(jìn)行有效干預(yù)，因此可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及程序性死亡等途徑對(duì)癌癥進(jìn)行治療[4]。

Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中的一員，但又與凋亡蛋白家族其他成員有所不同，是被克隆出來(lái)的一種凋亡抑制蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡，且具有腫瘤特異性，在正常組織中不表達(dá)，僅在胚胎發(fā)育組織及多數(shù)人類腫瘤組織中有不同程度表達(dá)，與多種癌細(xì)胞的分化增殖及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移均具有密切相關(guān)。且Survivin在癌癥患者體內(nèi)的過(guò)度表達(dá)將導(dǎo)致不良預(yù)后，同時(shí)還與放化療耐藥性密切相關(guān)[5]。Caspase是存在于角質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)相關(guān)半胱氨酸蛋白酶，屬于一種促凋亡因子，Caspase-3在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著不可替代的作用[6，7]。生理?xiàng)l件下Caspase-3以無(wú)活性的Caspase-3酶原形式存在，僅在細(xì)胞凋亡早期被上游蛋白酶切割方可被激活，激活后即可對(duì)胞漿胞核底物進(jìn)行裂解，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。

漢黃芩素是傳統(tǒng)中藥黃芩的活性提取物，其中抗腫瘤活性近年來(lái)引起了廣泛關(guān)注。目前關(guān)于該物質(zhì)抗膠質(zhì)瘤的機(jī)制并不清楚，學(xué)術(shù)界對(duì)此也未達(dá)成共識(shí)。但多家研究已證實(shí)，漢黃芩素具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[9，10]。而關(guān)于漢黃芩素作用于Survivin及Caspase-3從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的研究卻鮮有報(bào)道。筆者采用不同濃度漢黃芩素作用于人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)漢黃芩素抑制U251細(xì)胞增殖呈濃度及作用時(shí)間依賴性；而且應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)漢黃芩素作用于U251 48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。為了進(jìn)一步研究漢黃芩素抗膠質(zhì)瘤作用的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)先后采用Western blot及半定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中Survivin及Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果顯示，漢黃芩素可下調(diào)Survivin、上調(diào)Caspase-3的表達(dá)，上述作用與TMZ相當(dāng)甚至更具優(yōu)勢(shì)。Survivin抗細(xì)胞凋亡作用的機(jī)制可能是[11]：①通過(guò)結(jié)合細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CDK4，形成Survivin/CDK4復(fù)合物，釋放p21，進(jìn)而使CDK4與Procaspase-3相互作用達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用；②通過(guò)桿狀病毒的IAP重復(fù)序列分子中的Trp67、Pro33、Cys84等氨基酸殘基與Caspase-3結(jié)合從而抑制Caspase-3活性，進(jìn)而抑制由Caspase-3導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。本次研究結(jié)果顯示，漢黃芩素能夠下調(diào)Survivin、上調(diào)Caspase-3的表達(dá)，因此即可通過(guò)上述兩種可能的機(jī)制降低Survivin對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，而增強(qiáng)Caspase-3導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，漢黃芩素具有誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)可通過(guò)作用于Survivin、Caspase-3等蛋白的表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞凋亡或增殖起到一定調(diào)節(jié)作用。

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（收稿日期：2013-03-06）