硫酸鋅誘導(dǎo)金屬硫蛋白減輕再灌注肺細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要] 目的 探究硫酸鋅誘導(dǎo)金屬硫蛋白對(duì)再灌注肺細(xì)胞凋亡的影響。 方法 選取健康的雄性SD大鼠30只隨機(jī)分為對(duì)照組、標(biāo)準(zhǔn)組和實(shí)驗(yàn)組，觀察三組不同處理后的基本情況。 結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)組中的超氧化物歧化酶活性（95.7±25.7） U/mL，明顯低于對(duì)照組（152.4±24.5） U/mL和實(shí)驗(yàn)組（138.5±15.8） U/mL，標(biāo)準(zhǔn)組的丙二醛含量（8.8±1.7） nmol/mL、髓過(guò)氧化物酶的活性（25.6±1.7） NU/mL明顯高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。標(biāo)準(zhǔn)組的金屬硫蛋白含量（0.089±0.023） ng/mg明顯低于對(duì)照組的（0.154±0.042）ng/mg和實(shí)驗(yàn)組的（0.263±0.06） ng/mg。標(biāo)準(zhǔn)組的肺細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。 結(jié)論 硫酸鋅誘導(dǎo)金屬硫蛋白通過(guò)減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和中性粒細(xì)胞聚集，從而改善肺組織超微結(jié)構(gòu)的異常情況，并有效減輕再灌注肺細(xì)胞的凋亡。

[關(guān)鍵詞] 硫酸鋅；金屬硫蛋白；再灌注；細(xì)胞凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）12-0003-03

臨床中再灌注損傷的原因比較多，而且其具體的作用機(jī)制尚未明確。隨著臨床中不斷的研究，發(fā)現(xiàn)金屬硫蛋白是一種普遍存在于各種生物體中的多功能誘導(dǎo)蛋白，而且在不同病理的作用下，金屬硫蛋白的含量也會(huì)發(fā)生明顯的變化。臨床中大量的研究表明，金屬硫蛋白對(duì)再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用[1]。因此，為了進(jìn)一步了解金屬硫蛋白與再灌注肺細(xì)胞凋亡之間的聯(lián)系，本文對(duì)硫酸鋅誘導(dǎo)金屬硫蛋白對(duì)再灌注肺細(xì)胞凋亡的影響進(jìn)行深入探究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

選取健康雄性SD大鼠，共計(jì)30只，均由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心所提供，體重為210～270 g，平均（235.5±5.8） g，且均為清潔級(jí)。并采取隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、標(biāo)準(zhǔn)組和實(shí)驗(yàn)組，每組均為10只，且三組大鼠的年齡和體重以及飼養(yǎng)方法等比較無(wú)明顯的差異（P > 0.05）。

1.2 儀器與試劑

儀器：RM2135型切片機(jī)、H-7500型透射電鏡。試劑：丙二醛（MDA）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）和超氧化物歧化酶（SOD）均由南京建成公司提供，In Situ Cell Death Detection Kit由瑞士Roche公司提供，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和大鼠MT ELISA試劑盒均由上海西唐生物科技有限公司提供。

1.3 模型制備

首先，將選取的大鼠進(jìn)行腹腔注射5.0%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，并將其固定在鼠臺(tái)上。然后在頸部正中進(jìn)行切開(kāi)，并進(jìn)行有效的分離氣管和右側(cè)頸動(dòng)脈，緊接著給予氣管切開(kāi)和插管處理，并給予動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行通氣。其次，沿著大鼠的左胸骨進(jìn)行切斷第3和第4以及第5肋骨，并打開(kāi)取胸腔，并游離于左肺門(mén)，進(jìn)行穿過(guò)阻斷帶處理。對(duì)照組10只大鼠在左肺門(mén)游離后，進(jìn)行留置阻斷帶，并進(jìn)行觀察150 min；而標(biāo)準(zhǔn)組在阻斷左肺門(mén)后，進(jìn)行觀察30 min，并再次開(kāi)放再灌注120 min；而實(shí)驗(yàn)組的10只大鼠在術(shù)前24 h給予注射3.6% ZnSO4（1.5 mL/kg），然后在阻斷左肺門(mén)之后，進(jìn)行觀察30 min，并再次開(kāi)放再灌注120 min。

1.4 金屬硫蛋白測(cè)定

在進(jìn)行模型制備實(shí)驗(yàn)之后，選取大鼠左肺組織并制成10.0%的組織漿，然后采取BCA法測(cè)定組織中的總蛋白含量，并采取雙抗體夾心ABC-ELISA法測(cè)定組織漿中的金屬硫蛋白含量，肺組織中金屬硫蛋白濃度為組織漿中的金屬硫蛋白含量占總蛋白含量的比[2]。

1.5 血清指標(biāo)測(cè)定

在進(jìn)行模型制備實(shí)驗(yàn)之后，抽取大鼠頸動(dòng)脈血液2 mL，并進(jìn)行離心處理，3 000 r/min，離心10 min。然后依據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行規(guī)范性操作，并測(cè)定血清中的丙二醛（MDA）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）和超氧化物歧化酶（SOD）含量[3]。

1.6 肺組織細(xì)胞凋亡測(cè)定

肺組織細(xì)胞凋亡的測(cè)定主要采取原位缺口末端標(biāo)記法進(jìn)行測(cè)定[4]，將每組大鼠進(jìn)行肺組織石蠟切片處理，并選取1張，然后進(jìn)行脫蠟-水化處理。然后，①給予蛋白酶K進(jìn)行處理20 min，溫度為37℃；②加入TUNEL restion mixture 50 μL/片，并溫度控制為37℃，反應(yīng)時(shí)間為1 h；③加入Conver-POD，溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min；④采取二氨基聯(lián)苯胺（DAB）進(jìn)行顯色處理；⑤進(jìn)行蘇木素復(fù)染處理；⑥高倍鏡下選取5個(gè)不同的高倍視野（×400）觀察。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7 電鏡觀察方法

選取大鼠左肺門(mén)旁的組織，大小為1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm。并給予2.5%戊二醛進(jìn)行前固定，給予1.0%的餓酸進(jìn)行后固定處理，并給予梯度乙醇丙酮進(jìn)行脫水處理，并進(jìn)行Epon812包埋處理，進(jìn)行超薄切片，同時(shí)，采取醋酸硝酸鉛進(jìn)行雙重染色，并在H-7500型透射電鏡下進(jìn)行觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 金屬硫蛋白含量

2.3 肺組織超微結(jié)構(gòu)觀察

通過(guò)對(duì)三組大鼠的肺組織超微結(jié)構(gòu)觀察分析，對(duì)照組大鼠的毛細(xì)血管和肺泡Ⅰ型和Ⅱ型的上皮結(jié)構(gòu)均正常；標(biāo)準(zhǔn)組大鼠的毛細(xì)血管內(nèi)出現(xiàn)有炎癥細(xì)胞，而且肺泡腔中出現(xiàn)有大量的滲出，其巨噬細(xì)胞也比較活躍。Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞吞飲小泡均減少，而Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)水腫，且核膜增粗和擴(kuò)張，板層小體減少，顏色也由原來(lái)的深變淡；實(shí)驗(yàn)組大鼠的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞水腫并不明顯，而且線粒體的染色也較深，Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞吞飲小泡也較多，而Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞表面的微絨毛也輕度減少，且核固縮現(xiàn)象也不明顯，肺泡隔基本上處于正常水平。

2.4 相關(guān)因素和肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)分析

3 討論

再灌注損傷在臨床中比較常見(jiàn)，目前對(duì)于發(fā)病的機(jī)制并未完全了解。但通過(guò)對(duì)其分析，發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生與氧自由基的損傷和細(xì)胞的凋亡以及細(xì)胞內(nèi)的鈣超載損傷等因素有關(guān)[5]。而且資料顯示，金屬硫蛋白能夠有效地調(diào)節(jié)金屬離子的代謝，并具有對(duì)重金屬解毒的功能，從而清除氧自由基的抗氧化功能，起到抗細(xì)胞凋亡的效果[6]。

通過(guò)本次臨床研究分析，術(shù)前給予硫酸鋅可誘導(dǎo)金屬硫蛋白，并減輕脂質(zhì)過(guò)氧化的反應(yīng)和中性粒細(xì)胞的聚集，從而改善肺組織超微結(jié)構(gòu)的異常情況，并有效減輕對(duì)再灌注肺細(xì)胞的凋亡[7，8]。本組資料顯示，標(biāo)準(zhǔn)組的肺組織中金屬硫蛋白含量明顯低于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的肺組織中金屬硫蛋白含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此分析，在給予硫酸鋅進(jìn)行誘導(dǎo)后能夠提高肺組織中的金屬硫蛋白含量，從而增強(qiáng)其抗細(xì)胞凋亡的作用[9]；而且資料還顯示，標(biāo)準(zhǔn)組中的超氧化物歧化酶活性明顯低于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的超氧化物歧化酶活性，而且標(biāo)準(zhǔn)組的丙二醛含量和髓過(guò)氧化物酶的活性明顯高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的丙二醛含量和髓過(guò)氧化物酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而且標(biāo)準(zhǔn)組的大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)存在異常，而實(shí)驗(yàn)組的大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)異常情況明顯改善[10]。

通過(guò)對(duì)相關(guān)因素和肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)的分析，丙二醛含量和髓過(guò)氧化物酶與肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)呈正相關(guān)，而超氧化物歧化酶和金屬硫蛋白與肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。由此說(shuō)明，在術(shù)前給予硫酸鋅能夠有效誘導(dǎo)金屬硫蛋白含量增加，并使其能夠直接作用于脂質(zhì)過(guò)氧化的反應(yīng)和中性粒細(xì)胞的聚集，從而改善肺組織超微結(jié)構(gòu)的異常情況，并有效地減輕對(duì)再灌注肺細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，在給予硫酸鋅誘導(dǎo)金屬硫蛋白后，能夠有效地降低再灌注肺細(xì)胞的凋亡。

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（收稿日期：2013-01-28）