308nm激光聯(lián)合胡椒堿在白癜風(fēng)動(dòng)物模型中的應(yīng)用研究

[摘要] 目的 探討308 nm激光聯(lián)合胡椒堿對豚鼠表皮中黑素細(xì)胞的影響，觀察聯(lián)合療法對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的安全性和療效。 方法 豚鼠背部分別以聯(lián)合療法組、308 nm激光組、胡椒堿組、陽性對照組及空白對照組作用。5周后對不同觀察組脫色區(qū)皮膚進(jìn)行色素生成肉眼觀察和皮膚活檢。觀察治療前后病理切片中黑素顆粒的改變及黑素細(xì)胞數(shù)目。 結(jié)果 治療5周后，肉眼觀察除空白對照組外，4組均能促進(jìn)豚鼠皮膚色素沉著。聯(lián)合治療組多巴陽性黑素細(xì)胞數(shù)及黑素顆粒均較其他3組不同程度增多（P < 0.05），與陽性對照組比較差異無顯著性（P > 0.05）。結(jié)論 308 nm激光聯(lián)合胡椒堿對豚鼠背部皮膚有明顯增色作用，具有促進(jìn)黑素增值和黑素合成的功能。

[關(guān)鍵詞] 308 nm激光；胡椒堿；黑素細(xì)胞；豚鼠

[中圖分類號(hào)] R758.4+1；R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）28-0013-03

白癜風(fēng)是臨床常見的色素脫失性皮膚病，病因及發(fā)病機(jī)制不明[1]。研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸酶在白癜風(fēng)發(fā)病中起關(guān)鍵作用[2]，在正常情況下，其氧化的中間物的破壞作用可能為一種保護(hù)機(jī)制所消除，一旦缺少此種保護(hù)機(jī)制，黑素細(xì)胞便有被破壞的可能。我們曾對308 nm激光聯(lián)合胡椒堿對小豚鼠B16黑素瘤細(xì)胞黑素合成的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)308 nm激光聯(lián)合胡椒堿對酪氨酸酶及酪氨酸相關(guān)蛋白酶具有較強(qiáng)的激活及保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上以棕色豚鼠為動(dòng)物模型進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究聯(lián)合療法對動(dòng)物的安全性、療效及作用機(jī)制，為今后治療白癜風(fēng)患者奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

健康棕黃色豚鼠10只，重量250～350 g，中國科學(xué)院昆明生物所購買。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）抗體、左旋多巴、DAB染料、SP免疫組化試劑盒均由湖北Dr.too生物公司購買，其他試劑為市售合格產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 分5組。聯(lián)合療法組：308 nm準(zhǔn)分子激光（EL）以能量300 mJ/cm2照射并聯(lián)合0.5 mmo/L 胡椒堿；EL激光組：僅以能量300 mJ/cm2照射豚鼠；胡椒堿組：以0.5 mmol/L胡椒堿作用于豚鼠；陽性對照組：EL聯(lián)合8-Mop（0.1 mmol/L）；空白對照組：僅加入等量相應(yīng)溶媒，不照射。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 照射方法 豚鼠背部脫毛。隨機(jī)取4個(gè)相離區(qū)域，各組累積照射劑量為300 mJ/cm2，照射起始劑量按200 mJ/cm2。以后根據(jù)紅斑反應(yīng)適當(dāng)調(diào)整。未出現(xiàn)紅斑或發(fā)生紅斑持續(xù)未超過24 h者，加（50～100） mJ/cm2；超過24 h者劑量不變；出現(xiàn)明顯反應(yīng)者，暫停治療，癥狀緩解后下次照射劑量減少（50～100）mJ/cm2，每周治療3次。胡椒堿濃度設(shè)定為0.5 mmol/L，8-Mop實(shí)驗(yàn)濃度為0.1 mmol/L，2次/d，連續(xù)治療5周，對照射過部位皮膚進(jìn)行活檢，做不同染色。

1.2.3 聯(lián)合療法對白癜風(fēng)豚鼠模型脫色區(qū)色素生成肉眼觀察 肉眼觀察色素恢復(fù)情況，恢復(fù)程度以百分比計(jì)。

1.2.4 HE染色 常規(guī)石蠟切片，蘇木一伊紅染色。

1.2.5 聯(lián)合療法對白癜風(fēng)豚鼠模型脫色區(qū)色素生成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)

（1）黑素合成情況檢測 Fontana-Masson法對黑素顆粒進(jìn)行染色。黑素顆粒分布標(biāo)準(zhǔn)為5級(jí)：1級(jí)為棘層和基底層細(xì)胞少量黑素顆粒；2級(jí)為以基底層為主不連續(xù)的黑素顆粒；3級(jí)為以基底層和棘層為主的連續(xù)呈帶狀分布的黑素顆粒；4級(jí)為在3級(jí)基礎(chǔ)上黑素顆粒呈大量連續(xù)的分布；5級(jí)為黑素顆粒密布于表皮全層。（2）MC增值情況 Zmokawa染色。用0.1 mol/L PBS液沖洗，置于1 mol/L溴化鈉37℃，5 h分離真表皮，PBS洗滌數(shù)次，表皮用5%福爾馬林固定， 0.1%多巴染色5 h，于顯微鏡下觀察，分別計(jì)數(shù)5個(gè)視野基底層所含多巴陽性數(shù)，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用成組計(jì)量資料F檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)過程使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 皮膚反應(yīng)

聯(lián)合治療組治療5周后，肉眼觀察評(píng)分為3分，有深褐色色素沉著，空白對照組無明顯色素恢復(fù)評(píng)分為0分。陽性對照組、EL激光組及胡椒堿組均能不同程度促進(jìn)豚鼠皮膚色素沉著。聯(lián)合治療組作用最強(qiáng)。治療中所有治療組未見任何皮膚不良反應(yīng)。

2.2 不同觀察組對棕黃色豚鼠背部皮膚多巴陽性黑素細(xì)胞增殖的影響

見表1和圖1～5。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 4個(gè)不同觀察組均能不同程度地增高表皮基底層多巴陽性細(xì)胞數(shù)，其中以聯(lián)合治療組作用最明顯。聯(lián)合治療組作用較空白對照組有顯著性差異（t=78.32，P<0.01），較EL激光組及胡椒堿組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（t=10.56，22.53；P<0.05）。較陽性對照組差異無顯著性（t=1.02，P>0.05）。

2.3 不同觀察組對棕黃色豚鼠背部皮膚黑素生成的影響

見表1。Fontana-Masson染色后，聯(lián)合治療組黑素顆粒分布情況為5級(jí)，黑素顆粒密布表皮全層，提示聯(lián)合療法組對皮膚黑素合成具有促進(jìn)作用?？瞻讓φ战M為1級(jí)，差異顯著（t=23.09，P<0.01），陽性對照組為4級(jí)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=1.03，P>0.05）。

3 討論

白癜風(fēng)是臨床最常見的皮膚和黏膜色素脫失性疾病[3]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，皮損處黑素細(xì)胞（melanocyte，MC）的缺失和減少是患者皮膚出現(xiàn)色素減退斑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。白癜風(fēng)嚴(yán)重影響患者容貌美觀，給患者的心理健康帶來明顯的損害。盡管目前關(guān)于白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制尚存在多種學(xué)說，如自身免疫、氧化應(yīng)激造成MC破壞或者功能受損等，但最終造成的結(jié)果就是MC減少、缺失和功能抑制[5]。因此白癜風(fēng)的治療也應(yīng)著眼于增加皮損區(qū)MC數(shù)量，活化MC功能。酪氨酸酶是皮膚黑素生成的主要促進(jìn)酶。許多治療都是通過上調(diào)該酶的生物活性來發(fā)揮作用的[6]。酪氨酸相關(guān)蛋白酶TRP-1和TRP-2可催化黑素生化合成過程中的后續(xù)步驟，在黑素細(xì)胞內(nèi)他們與酪氨酸酶一起以多酶復(fù)合體形式存在，并對該復(fù)合體起穩(wěn)定作用。治療上，盡管目前方法很多，但各種方法療效均不確切。308 nm準(zhǔn)分子激光是連續(xù)的脈沖氣體激光，屬UVB波長范圍[7]。EL是白癜風(fēng)治療領(lǐng)域最新的手段之一，其有效率高于其他方法已得到國內(nèi)外研究的公認(rèn)[8，9]。盡管擁有了這一手段，整體而言，白癜風(fēng)治療有效率仍不令人滿意[10]。本研究聯(lián)合胡椒堿治療，胡椒堿對黑素細(xì)胞的促進(jìn)作用在其他學(xué)者的研究中已得到認(rèn)可[11，12]。筆者前期研究證實(shí)308 nm激光聯(lián)合胡椒堿療法可促進(jìn)黑素合成及上調(diào)酪氨酸酶及酪氨酸相關(guān)蛋白酶活性，促進(jìn)黑素沉著，明確了聯(lián)合療法作用的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

為明確聯(lián)合療法在活體上的作用，我們選擇棕色豚鼠作為動(dòng)物模型，依據(jù)為棕色豚鼠皮膚黑素細(xì)胞與黃種人相類似，為聯(lián)合療法用于患者奠定初步基礎(chǔ)。觀察中我們發(fā)現(xiàn)，治療5周后，肉眼觀察聯(lián)合治療組、陽性對照組、EL激光組及胡椒堿組均能不同程度促進(jìn)豚鼠皮膚色素沉著，以聯(lián)合治療組作用最強(qiáng)。研究還發(fā)現(xiàn)，4組均能使豚鼠皮膚多巴陽性細(xì)胞數(shù)和含黑素顆粒細(xì)胞數(shù)不同程度的增高。聯(lián)合治療組作用最強(qiáng)。不同觀察組對豚鼠皮膚均無不良反應(yīng)。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的成功為臨床治療白癜風(fēng)提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2013-08-12）