豬DIO3基因組織表達譜及印記分析

摘要：采用熒光定量PCR方法分析了豬DIO3基因在組織中的表達狀況。結(jié)果表明，DIO3基因主要表達于背部脂肪組織，在肝臟、子宮、腎臟、心臟、小腸、肌肉和胃組織中呈中度表達，在脾臟和肺臟中表達量很低。采用外顯子687 bp處的A/C突變（A/C 687）檢測該基因在豬胚胎組織中的印記狀態(tài)，DIO3基因在所有組織中均表現(xiàn)為印記。

關(guān)鍵詞：豬；DIO3基因；組織表達譜；印記分析

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5345-03

Expression and Imprinting Analysis of Porcine DIO3 Gene

QIAO Mu1，WU Hua-yu1，HUANG Jing-shu2，PENG Xian-wen1，DU De-li3，LI Han-he3，

ZHANG Kai-xuan3，MEI Shu-qi1

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China； 2.Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Hubei Province，Wuhan 430064， China； 3.Wuhan Tianjian Agricultural Development Co.， Ltd.，Wuhan 430300，China）

Abstract： Real-time RT-PCR was performed to analyze the porcine DIO3 gene tissue expression pattern. The porcine DIO3 gene was expressed predominantly in backfat， mildly in liver， uterus， kidney， heart， small intestine， muscle and stomach， and almost absent in spleen and lung by realtime fluorescence quantitative PCR. A single nucleotide polymorphism in exon （A/C687） was used to investigate imprinting status in porcine embryonic tissues. The results indicate that DIO3 was imprinted in all the tested tissues.

Key words： pig； DIO3 gene； tissue expression； imprinting analysis

甲狀腺素脫碘酶Ⅲ（Deiodinase iodothyronine type Ⅲ，DIO3）能夠使四碘甲狀腺原氨酸（T4）和三碘甲狀腺原氨酸（T3）內(nèi)環(huán)脫碘導致甲狀腺激素失活[1]，在甲狀腺激素代謝過程中起著關(guān)鍵作用[2]。甲狀腺激素是調(diào)節(jié)機體生長發(fā)育及調(diào)控碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝的重要因子，DIO3基因通過調(diào)節(jié)甲狀腺激素的代謝而影響機體生長發(fā)育及營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，因此，DIO3是調(diào)控生長發(fā)育和營養(yǎng)代謝的重要調(diào)節(jié)因子。該基因在成人組織中活性很低，且僅表達于皮膚、子宮和腦等組織[3]，但是在蛻膜組織、胎盤組織和胎兒組織中表達量較高[4，5]。

基因組印記是一種基因表達依賴于其親本來源的表觀遺傳現(xiàn)象。盡管雙親來源的兩條染色體具有相同的遺傳序列，但是印記基因只表達一個親本來源的等位基因[6]。DIO3基因位于Dlk1-Dio3印記簇最遠端，在DLK1基因下游-800 kb處[7]。在小鼠中DIO3基因表現(xiàn)為母本印記、父本表達[8，9]。本研究采用PCR-RFLP方法分析了豬DIO3基因的印記狀態(tài)，并研究其表達模式，為進一步研究豬印記基因?qū)ωi生長發(fā)育的調(diào)控和功能基因的分子遺傳機理具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 動物和組織樣品

用于印記分析的樣品：采集自大白豬和梅山豬正反交后代65日齡胚胎（華中農(nóng)業(yè)大學試驗豬場）的10個部位組織（心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肺臟、胃、肌肉、小腸、胎盤和腦），分別提取DNA和RNA。

用于組織表達譜分析的樣品：采集自65日齡大白豬胚胎（湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所原種豬場）的心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肺臟、胃、肌肉、脂肪、小腸、子宮等組織，分別提取RNA。

DNA的提取采用傳統(tǒng)的苯酚/氯仿提取法。RNA的提取使用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒提取。反轉(zhuǎn)錄主要按照參考文獻[10]中的方法。

1.2 引物設計與PCR擴增DIO3基因

根據(jù)豬DIO3基因（GenBank accession No. HQ316945）設計引物進行PCR擴增DIO3基因，引物由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司合成，引物序列見表1。

1.3 實時熒光定量PCR

利用DOF/DOR引物，運用實時熒光定量PCR，對豬DIO3基因在65日齡大白豬胚胎的10個部位不同組織（心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肺臟、胃、肌肉、脂肪、小腸和子宮）中的表達情況進行分析。實時熒光定量PCR反應體系為25 μL，模板cDNA 50 ng，正、反向引物SYBR Green Mix 12.5 μL，ddH2O補至25 μL。每個樣品設3個重復。反應在LightCycler480實時熒光定量PCR儀上進行，同時以β-actinF/β-actinR引物擴增β-actin內(nèi)參基因，基因的相對表達水平以2-ΔΔCT值表示，數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進行分析，P<0.05表示差異顯著。

1.4 印記分析

用除DNA酶試劑盒處理雜合子個體的總RNA，然后再反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用引物ACF/ACR在65日齡胚胎的組織DNA水平進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶AcyⅠ酶切，篩選基因型為AC的雜合子個體，再對雜合子個體cDNA水平進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶AcyⅠ酶切，如果cDNA水平只表達一個親本的等位基因，另一個親本的不表達，則說明此基因是印記的。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬DIO3基因組織表達譜分析

運用實時熒光定量PCR對豬DIO3基因在10個不同組織中的表達情況進行了分析，結(jié)果見圖1。由圖1可知，豬DIO3基因在背部脂肪組織中表達量最高，其次是肝臟、子宮、腎臟、心臟和小腸組織，在脾臟、肺臟、胃和肌肉組織中表達量非常低。

2.2 豬DIO3基因多態(tài)性檢測

為了檢測外顯子687 bp處的A/C突變（A/C 687），依照DIO3基因序列（HQ316945）設計一對引物ACF/ACR（序列見表1），擴增產(chǎn)物長度為372 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶AcyⅠ酶切后，AA基因型為一條372 bp的片段， CC基因型產(chǎn)物為184 bp +188 bp兩條片段，AC基因型為372 bp+184 bp + 188 bp的片段（圖2）。

2.3 豬DIO3基因印記分析

為了檢測豬DIO3基因印記狀態(tài)，對大白豬和梅山豬正反交親本和子代的基因組DNA和cDNA進行基因分型。在大白豬和梅山豬正交和反交后代65 日齡胚胎中發(fā)現(xiàn)了適合做印記分析的雜合子個體。用限制性內(nèi)切酶AcyⅠ對ACF/ACR擴增的產(chǎn)物進行酶切，184 bp 和 188 bp來自于C等位基因，372 bp來自于A等位基因（圖2）。印記分析結(jié)果表明DIO3基因在65日齡胚胎組織中呈現(xiàn)出父本表達、母本印記（圖3）。

3 小結(jié)與討論

研究表明鼠DIO3基因主要表達于腦、胎盤、妊娠期子宮和肝臟組織[4，5，11]。本研究中發(fā)現(xiàn)豬DIO3基因在背部脂肪、肝臟和子宮組織中表達量高，在心臟、腎臟、胃、小腸和肌肉組織中表達量低，這與前人研究結(jié)果相一致。印記基因?qū)Σ溉閯游锱咛サ纳L、發(fā)育以及出生后的神經(jīng)發(fā)育和代謝具有重要的影響[12，13]。基因在不同組織中的表達水平反映了其相應的功能，豬DIO3基因在背部脂肪表達量高，說明該基因在控制脂肪分化和調(diào)控脂肪代謝過程中可能起著重要的作用[14]。豬DIO3基因在子宮中表達量高，揭示其可能與豬的繁殖性能相關(guān)，為了解調(diào)控豬脂肪沉積和繁殖性能的分子生物學機制提供了有價值的信息。

DIO3基因定位于人染色體的14q32，小鼠染色體的12F1，這些區(qū)域包含眾多的印記基因，該基因在人的皮膚組織以及小鼠的胎兒組織中都表現(xiàn)為父本表達[15，16]。本研究發(fā)現(xiàn)豬DIO3基因在胚胎發(fā)育的65日齡階段所檢測的組織中都表現(xiàn)為父本表達，與人和小鼠的研究結(jié)果一致。這表明在不同物種中DLK1-DIO3區(qū)域的基因組印記具有保守性。

本研究對豬DIO3基因的組織表達譜、印記狀態(tài)進行了分析，為深入研究印記基因的功能及對豬生產(chǎn)性狀的影響提供了分子生物學基礎。

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