水霉菌蛋白制備方法的比較與分析

摘要：比較了3種方法對8種水霉菌（Saprolegnia）破壁處理制備蛋白的效果，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。結(jié)果表明，加石英砂和液氮混合研磨處理制備的蛋白效果最好，條帶清晰，該方法操作簡便、快捷、較為常用，可有效地區(qū)分水霉菌株分子遺傳學(xué)背景的差異，適用于水霉菌分子流行病學(xué)研究。

關(guān)鍵詞：水霉菌（Saprolegnia）；聚丙烯凝膠電泳；處理方法

中圖分類號：S941 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5342-03

Comparison and Analysis of Preparation Methods of Saprolegnia Protein

SONG Peng-peng，HU Kun，YANG Xian-le

（National Pathogen Collection Center for Aquatic Animals， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306，China）

Abstract： The effect of three wall-breaking methods of 8 kinds of Saprolegnia preparation was compared and analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. The results showed that the quartz sand and liquid nitrogen mixed grinding processing preparation of protein was best， the stripe was clear， the method was simple， quick， and relatively common， which could effectively distinguish between strains of molecular genetics background difference and was suitable for Saprolegnia molecular epidemiology research.

Key words： Saprolegnia； polyacrylamide gel electrophoresis； preparation method

目前，已發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致水生動物感染水霉病的真菌有水霉屬（Saprolegnia）、綿霉屬（Achlya）、細(xì)囊霉屬（Leptolegnia）、絲囊霉屬（Aphanomyces）、腐霉屬（Pythium）和異霉屬（Allomyces）的13 種真菌，其中以水霉、綿霉、細(xì)囊霉和絲囊霉最為常見，也最為容易導(dǎo)致水霉病的大面積蔓延和流行。傳統(tǒng)的真菌病原菌分類主要根據(jù)其感染部位、體外培養(yǎng)的形態(tài)、生理生化指標(biāo)以及有性生殖過程的形態(tài)特征等。但這些鑒定方法主觀性強(qiáng)、程序繁瑣、重復(fù)性差、周期很長，且形態(tài)特征易受環(huán)境等因素的影響，加上穩(wěn)定性和分類能力上受到很多限制，因此往往很難能鑒定到種。隨著對卵菌綱生物的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)等方面的深入研究，推動了水霉菌分類鑒定的發(fā)展。在基礎(chǔ)分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的研究中，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)被認(rèn)為是應(yīng)用最為廣泛的方法之一。聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的分離、鑒定及其結(jié)構(gòu)與功能的分析，該方法操作簡便、快捷、較為常用，可為不同水霉菌菌株的分類提供技術(shù)手段[1]。

研究表明外膜蛋白是真菌外膜中的蛋白成分，外膜蛋白結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，遺傳突變性小，且種間差異明顯，因此外膜蛋白常用于研究細(xì)菌性和真菌性病原菌株的流行病學(xué)特征。因此，本研究對水霉菌外膜蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，比較分析了外膜蛋白，可為真菌的致病性和流行病學(xué)的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

水霉菌分別分離[2]于湖北、廣州、上海等地區(qū)患水霉病的淡水養(yǎng)殖水生動物病變組織（表1）；標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 200013為國家水生動物病原庫提供。

1.2 菌絲培養(yǎng)

試管斜面活化后，接入PDA平板內(nèi)，20 ℃培養(yǎng)24～36 h，然后轉(zhuǎn)接入9 cm鋪有玻璃紙的平板內(nèi)，平板培養(yǎng)基為PDAY（PDA+0.2%酵母膏）。每皿接入5 mm2的小菌塊4～5塊，均勻分布于玻璃紙表面，20 ℃培養(yǎng)36～48 h，小心取出接種菌塊。用刀片從玻璃紙表面刮取菌絲，收集于小培養(yǎng)皿中，真空干燥12～24 h，分裝于1.5 mL離心管中-20 ℃保存?zhèn)溆肹3]。

1.3 破壁處理

采用3種方法對水霉菌進(jìn)行破壁處理。方法1：取1.0 g菌絲體，加10 mL 1×PBS緩沖液，振蕩混勻，加石英砂100 mg，研磨20 min，成糊狀。方法2：取1.0 g菌絲體，液氮研磨，成白色粉末狀，加10 mL 1×PBS緩沖液，振蕩混勻。方法3：取1.0 g菌絲體，加石英砂100 mg，再加液氮研磨成白色粉末狀，加10 mL 1×PBS緩沖液，振蕩混勻[4]。

1.4 樣品制備

3種破壁方法處理后得到的處理液分別于4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液，加1倍體積預(yù)冷的丙酮，置于-20 ℃過夜，然后4 ℃、12 000 r/min離心5 min，收集沉淀，用1 mL ddH2O溶解蛋白質(zhì)沉淀，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠濃縮膠濃度為5%（pH 6.8），分離膠濃度為10%（pH 8.8），指示劑為溴酚藍(lán)，電泳緩沖液為1×Tris-Gly緩沖液（pH 8.3），加10%SDS。取5 μL蛋白質(zhì)樣品，加1倍體積2×上樣緩沖液（含20%DDT）；樣品煮沸5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳在冰浴中進(jìn)行，當(dāng)溴酚藍(lán)距膠底2 cm左右時(shí)停止電泳。

1.6 染色

取出凝膠，置于過濾后的考馬斯亮藍(lán)染色液（含0.2%考馬斯亮藍(lán)R-250、10%冰醋酸、50%甲醇）中，室溫下?lián)u床緩慢旋轉(zhuǎn)，1 h后將凝膠浸入考馬斯亮藍(lán)脫色液（含30%甲醇、10%冰醋酸）中，室溫下?lián)u床緩慢脫色，脫色數(shù)次直至蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)、背景干凈為止。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲體蛋白制備方法的比較

利用3 種不同組合的方法制備水霉菌株可溶性菌絲體蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。從圖1可以看出，方法3制備的蛋白較方法1和2完整，顯帶最多、清晰；方法2制備的蛋白較方法1完整，條帶較多且較清晰；方法1比方法2和方法3的條帶少且不清晰，效果最差。

2.2 水霉菌株蛋白條帶的差異分析

從圖2可以看出，02和LP條帶基本一致，S2、L5條帶基本一致，AT、CP和S1條帶基本一致，04和14條帶基本一致。聚丙烯凝膠電泳能夠有效地區(qū)分不同種類的水霉菌，能夠?yàn)樗咕攴诸愄峁┛煽康姆诸惣夹g(shù)。

3 小結(jié)與討論

3.1 蛋白制備方法分析

聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離、鑒定、純化蛋白質(zhì)的方法之一，是以聚丙烯酰胺凝膠為載體的一種區(qū)帶電泳。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N-甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子，凝膠內(nèi)部是帶有酰胺側(cè)鏈的碳-碳聚合物，很少帶有離子側(cè)基，因而電滲作用小，不易與樣品相互作用。聚丙烯酰胺凝膠電泳過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開[5，6]。本試驗(yàn)通過不同的破壁處理方式來探究蛋白制備方法的差異性，從而篩選出較好的制備方法，方法3的制備效果明顯好于方法1和方法2，表明蛋白質(zhì)的制備效果受諸多因素的影響，在選擇SDS-PAGE電泳方法時(shí)，必須根據(jù)自己的研究對象（物種）、研究目的（蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量范圍）和蛋白質(zhì)的制備方法等因素進(jìn)行比較和優(yōu)化，才能從中篩選出最佳制備方案。

3.2 水霉菌株種間差異分析

研究表明外膜蛋白型結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，遺傳突變性小，且種間差異明顯[5-7]，因此外膜蛋白分析常用于研究細(xì)菌性和真菌性病原菌株的流行病學(xué)特征。本研究中菌株02和LP條帶基本一致，說明采集不同地方的菌株有可能菌株相似，S2、L5條帶基本一致，以及04和14條帶基本一致，說明采集相同地域的菌株，菌株之間有很大的相似性，AT、CP和S1條帶基本一致，這與王素英等[8]、牛桂蘭等[9]提出可以通過比較未知菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株外膜蛋白型的相似性來確定真菌種類的方法一致，表明聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)能夠區(qū)分水霉，從而達(dá)到為水霉菌株的分類鑒定提供技術(shù)手段。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊 平，鐘 劍，雷 帆，等. 絲狀真菌Pythium sp.GY1938菌株蛋白圖譜染色方法的比較及優(yōu)化[J].中國病原生物學(xué)雜志，2011，6（9）：675-678.

[2] 夏文偉，曹海鵬，王 浩，等.彭澤鯽卵源致病性水霉的鑒定及其生物學(xué)特性[J].微生物學(xué)通報(bào)，2011，38（1）：57-62.

[3] 曾大興. 適于RAPD分析的真菌DNA提取方法[J]. 生物技術(shù)，2003，13（2）：20-21.

[4] 萬其兵，劉麗麗，楊秀英.真菌細(xì)胞破壁方法的研究[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，24（4）：38-40.

[5] 孫建和，嚴(yán)亞賢，陳懷青，等. 致病性嗜水氣單胞菌保護(hù)性抗原的研究[J]. 中國人獸共患病雜志，1997，13（3）：20-23.

[6] 高 崧，劉秀梵，張如寬.我國部分地區(qū)禽源大腸桿菌的外膜蛋白型[J]. 微生物學(xué)報(bào)，1999，39（3）：226-233.

[7] MARIA M N， SUSANA M， ALICIA A， et al. Cloning， sequencing， and role in serum susceptibility of porin II from mesophilic Aeromonas hydrophila[J]. Infection and Immunity，2000，68（4）：1849-1854.

[8] 王素英，楊曉麗.全細(xì)胞蛋白聚類分析的可行性[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2000，31（1）：88-91.

[9] 牛桂蘭，湯顯春，劉進(jìn)學(xué)，等.金礦床區(qū)蠟狀芽孢桿菌孢壁蛋白SDS-PAGE圖譜及聚類分析[J].微生物學(xué)雜志，2002，22（2）：24-25.