金蓮花中綠原酸提取工藝的優(yōu)化及其含量比較

摘要：通過單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化微波輻射法提取金蓮花（Trollius chinensis）中綠原酸的最佳工藝，并測定金蓮花中綠原酸的含量。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為微波輻射功率450 W，料液比1∶25，乙醇體積分數(shù)70%，微波輻射時間45 min，提取溶劑的pH為7。人工種植金蓮花綠原酸含量較高，為6.686%。說明人工種植的金蓮花能夠滿足藥用。

關(guān)鍵詞：金蓮花（Trollius chinensis）；綠原酸；提取工藝；人工種植；含量

中圖分類號：R284.2；R282.71 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5296-03

Optimization of Extraction of C

hlorogenic Acid in Globeflower and Its Content Comparison

LIANG Yong-feng

（College of Chemistry and Chemical Engineering， Ningxia Teachers University， Guyuan 756000，Ningxia，China）

Abstract： Single factor tests and orthogonal experiment were adopted to study the optimization of extraction of chlorogenic acid in globeflower（Trollius chinensis） by the microwave extraction method and the content of chlorogenic acid in globeflower was determined. The results showed that the optimum extraction conditions were microwave power 450 W， the ratio of the material to liquid 1∶25， volume fraction of ethanol 70%， microwave irradiation time 45 min and solvent pH 7. The content of chlorogenic acid in artificial planting globeflower was higher than the wild varieties，reaching 6.686%. The artificial planting globeflower there fore could be used in the medicinal application.

Key words： globeflower（Trollius chinensis）； chlorogenic acid； extraction technology； artificial planting； content

金蓮花（Trollius chinensis）為毛茛科（Ranunculaceae）植物的干燥花，又稱旱荷、寒荷、陸地蓮、旱地蓮、金梅草、金疙瘩、旱金蓮，其味苦、性寒、無毒，可治口瘡喉腫、浮熱牙宣、耳疼目痛[1]。全世界約有25種，其中我國有16種[2]，主要分布于河北、山西、內(nèi)蒙古、新疆、四川、云南、陜西、甘肅、青海等省，山西、河北省是傳統(tǒng)的金蓮花道地產(chǎn)地和栽培地[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，金蓮花具有抗菌、抗病毒等活性，用于治療慢性扁桃體炎、感冒、發(fā)燒、急性鼓膜炎、尿路感染等其他炎癥[4]。金蓮花除了主要含有黃酮類化合物外，還含有綠原酸[5]， 綠原酸具有抗菌作用。因此，綠原酸含量的高低也是評判金蓮花質(zhì)量的標準之一[6]。

本試驗采用單因素試驗和正交試驗，優(yōu)化微波輻射提取金蓮花中綠原酸的最佳工藝。通過測量寧夏回族自治區(qū)人工種植金蓮花不同部位綠原酸的含量，并與野生金蓮花中綠原酸含量進行比較來判斷其藥用價值，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)金蓮花提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

人工種植金蓮花，采自寧夏隆德縣西北中藥材有限責(zé)任公司種植基地；河北省承德、山西省五臺山、內(nèi)蒙古赤峰、吉林省長白山產(chǎn)的野生金蓮花購買于寧夏明德中藥飲片有限公司，由中藥師、職業(yè)藥劑師趙建軍鑒定。將所采樣品放入恒溫箱中，在60 ℃烘干至恒重，取出后自然陰干，粉碎，過80目篩，備用；綠原酸標準品（中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分數(shù)99%），乙醇、H2SO4、NaOH等試劑均為分析純。

2012年10—12月在寧夏師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院分析化學(xué)實驗室完成提取工藝優(yōu)化和含量測定。

1.2 儀器

UV-2450型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；XH-300A型微波催化合成/萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；FW-177型中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；pHs-2C型精密酸度計（上海雷磁儀器廠）；L-S型電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制 準確稱取綠原酸標準品1.0 mg，用乙醇溶解定容至50 mL，配制成20 μg/mL的綠原酸對照品儲備液。取0.5 mL綠原酸對照品儲備液于10 mL量瓶中，加乙醇定容，搖勻，用UV-2450 型紫外可見光分光光度計在200～400 nm 波長范圍內(nèi)掃描，確定綠原酸標準品的最大吸收波長為329 nm。用乙醇將綠原酸標準對照品配制成 2.0、5.0、7.5、10.0、12.5 μg/mL 5個質(zhì)量濃度的溶液，在波長329 nm下測定其吸光度（A）。以吸光度（A）為縱坐標，綠原酸質(zhì)量濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為：A=0.055 30C-0.003 395，R2=0.999 7，表明綠原酸標準品在1～15 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

1.3.2 金蓮花中綠原酸含量的測定 準確稱取1.00 g粉碎的金蓮花樣品，按料液比1∶25、乙醇體積分數(shù)70%、pH 7下浸潤0.5 h，然后在微波輻射功率450 W下輻射45 min，浸提過濾，將濾渣在同樣條件下再浸提1次，合并2次所得濾液，60 ℃干燥，得到綠原酸粗提物。將綠原酸粗提物用0.2 mol/L HCl溶解[7]，定容至100 mL，得到綠原酸樣品溶液。

取樣品溶液0.1 mL，用乙醇溶解定容至50 mL，測定波長329 nm處樣品的吸光度。

綠原酸的提取量=綠原酸質(zhì)量濃度×10-6×稀釋倍數(shù)

綠原酸的含量=綠原酸的提取量×100/金蓮花樣品質(zhì)量

1.3.3 單因素試驗 采用單因素試驗分別考察微波輻射功率400、450、500、550、600 W，料液比（g∶mL）1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，乙醇溶劑體積分數(shù)50%、60%、70%、80%、90%，微波輻射時間30、45、60、75、90 min，溶劑pH 4、5、6、7、8，對微波輻射提取金蓮花中綠原酸的影響。每個因素試驗均稱取1.00 g金蓮花5份，除變量因素外，選擇微波輻射功率500 W，乙醇質(zhì)量分數(shù)70%，微波輻射時間45 min，pH為7，固定料液比1∶20進行試驗。

1.3.4 正交試驗 以綠原酸含量為檢測指標，采用 L16（45）正交試驗來篩選提取金蓮花中綠原酸的最佳工藝，因素和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

不同試驗因素對綠原酸含量的影響不同。微波輻射功率為400、450、500、550、600 W時，綠原酸質(zhì)量分數(shù)分別為4.532%、5.164%、5.391%、5.186%和4.495%，故確定最適宜的微波輻射功率為500 W；料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30時，綠原酸質(zhì)量分數(shù)分別為3.689%、4.532%、5.541%、5.569%和5.563%，故確定最適宜的料液比為1：25；乙醇溶劑體積分數(shù)為50%、60%、70%、80%、90%時，綠原酸質(zhì)量分數(shù)分別為4.313%、4.914%、5.536%、4.592%和3.941%，確定用體積分數(shù)70%的乙醇提取金蓮花中綠原酸的效果最好；微波輻射時間為30、45、60、75、90 min，綠原酸質(zhì)量分數(shù)分別為4.946%、5.638%、5.103%、4.625%和4.102%，確定適宜的微波輻射時間是45 min；pH為4、5、6、7、8時，綠原酸質(zhì)量分數(shù)分別為4.164%、4.534%、5.016%、5.438%和4.803%。因此，最適宜提取綠原酸的條件是pH為7。

2.2 正交試驗結(jié)果

從表2可知，在本試驗條件下，影響金蓮花中綠原酸提取的主要因素是乙醇溶劑體積分數(shù)，影響從大到小依次為C、D、E、B、A，即乙醇溶劑體積分數(shù)、微波輻射時間、提取溶劑酸堿性、料液比、微波輻射功率，最佳工藝條件是A2B3C2D2E4。

方差分析結(jié)果（表3）顯示，對微波輻射下提取金蓮花中綠原酸顯著影響的因素是乙醇溶劑體積分數(shù)和微波輻射時間，而微波輻射功率、料液比和溶劑pH對綠原酸的提取無顯著影響。因此，提取過程中應(yīng)嚴格控制乙醇溶劑體積分數(shù)和微波輻射時間，微波輻射功率可降低，輻射時間可適當縮短。結(jié)合乙醇溶劑體積分數(shù)和微波輻射功率對金蓮花中綠原酸提取率的影響，在其他因素水平不變的情況下微波輻射法提取金蓮花中綠原酸，乙醇溶劑的體積分數(shù)確定為70%，微波輻射功率為450 W時提取效果最好。根據(jù)正交試驗結(jié)果綜合考慮，最佳提取工藝為微波輻射功率450 W，料液比1∶25，乙醇溶劑體積分數(shù)70%，微波輻射時間45 min，提取溶劑的pH為7。

2.3 驗證試驗結(jié)果

取適量粉碎后的金蓮花藥材，在正交試驗所得優(yōu)化提取工藝條件下進行驗證試驗，得到綠原酸質(zhì)量分數(shù)為6.686%（n=3）。表明在上述工藝條件下，提取的綠原酸含量高，達到優(yōu)化工藝的目的。

2.4 金蓮花中綠原酸含量的比較

2.4.1 不同產(chǎn)地金蓮花中綠原酸含量的比較 對來自河北省承德、山西省五臺山、內(nèi)蒙古赤峰、吉林省長白山產(chǎn)的野生金蓮花和寧夏隆德人工種植的金蓮花進行綠原酸提取，在正交試驗所得優(yōu)化提取工藝條件下，得到綠原酸提取率分別為5.642%、5.685%、4.728%、4.573%、6.686%（n=3）。通過與河北省承德、山西省五臺山、內(nèi)蒙古赤峰、吉林省長白山產(chǎn)的野生金蓮花綠原酸含量的比較，寧夏隆德人工種植的金蓮花綠原酸含量高于河北、山西等地產(chǎn)的金蓮花，完全能夠滿足藥用。

2.4.2 金蓮花不同部位綠原酸含量的比較 為了進一步開發(fā)金蓮花的藥用價值，在正交試驗所得優(yōu)化提取工藝條件下對人工種植金蓮花不同部位的綠原酸進行提取，提取部位為花、葉、莖和根，所得綠原酸提取率分別為6.686%、4.683%、3.192%、1.281%（n=3）。

3 小結(jié)與討論

1）綠原酸的提取率隨微波輻射功率增大而增加，但是當微波輻射功率大于500 W時，綠原酸的提取率又開始降低。可能是因為隨著微波功率的增加，對金蓮花細胞的破碎作用加強，綠原酸提取率增大，但當微波功率繼續(xù)增大時，隨著對細胞破碎作用的加強，溶解雜質(zhì)也增大，有效成分溶解量減少，綠原酸提取率沒有提高反而下降。

2）綠原酸的提取率隨料液比的減少而增加。隨著料液比的減少，溶劑與原料接觸越充分，二者的傳質(zhì)作用增強，綠原酸的提取率增大；當料液比小于1∶25時，提取率有所減小；如果繼續(xù)減少料液比，一是給綠原酸的純化帶來困難，二是浪費了溶劑。因此，確定料液比1∶25是金蓮花中綠原酸提取適宜的料液比。

3）本試驗中，隨著乙醇溶劑體積分數(shù)的增大，金蓮花中綠原酸提取率增加，當乙醇溶劑體積分數(shù)超過70%時，提取率反而下降。隨著乙醇溶劑體積分數(shù)的增加，乙醇對金蓮花溶解度增大，綠原酸的提取率也隨之增大；當乙醇體積分數(shù)超過70%時，金蓮花組織內(nèi)的一些綠原酸不易被乙醇萃取，同時一些雜質(zhì)如葉綠素等脂溶性物質(zhì)的溶出量也隨之增大，綠原酸提取率下降[8]。

4）綠原酸的提取率隨微波輻射時間的延長而增加，微波輻射時間在45 min時，提取率最高；當輻射時間大于45 min時，提取率反而降低。這可能是隨著微波輻射時間的增加，提取物的雜質(zhì)也隨著增加，這些雜質(zhì)可能會吸附綠原酸，造成綠原酸提取率降低。

5）綠原酸的提取率隨溶劑pH的增大而增加，但pH大于7時，綠原酸的提取率又開始降低。這與綠原酸本身是一種有機酸有關(guān)，堿性條件下一部分綠原酸可能發(fā)生解離，導(dǎo)致綠原酸提取率下降。

4 小結(jié)

根據(jù)正交試驗結(jié)果，綜合考慮影響微波輻射下提取金蓮花中綠原酸的顯著因素是乙醇溶劑體積分數(shù)和微波輻射時間，因此應(yīng)嚴格控制乙醇溶劑體積分數(shù)和微波輻射時間。最佳提取工藝條件是微波輻射功率450 W，料液比1∶25，乙醇溶劑體積分數(shù)70%，微波輻射時間45 min，提取溶劑pH為7。人工種植的金蓮花中綠原酸含量較高，完全能夠滿足藥用。除了花外，金蓮花的葉、莖中也含有較多的綠原酸，因此可以考慮將金蓮花的葉、莖作為藥用部位，進一步開發(fā)金蓮花的藥用價值。

參考文獻：

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