固定化技術(shù)在殼聚糖酶生產(chǎn)中的應(yīng)用

摘要：以產(chǎn)酶活性與產(chǎn)酶穩(wěn)定性為指標(biāo)評(píng)價(jià)3種固定化細(xì)胞產(chǎn)殼聚糖酶（Chitosanase， EC3.2.1.99）方法，以酶比活力、酶結(jié)合效率、酶活力回收率及穩(wěn)定性評(píng)價(jià)4種固定化殼聚糖酶方法，以篩選最優(yōu)固定化方案應(yīng)用于殼聚糖酶的生產(chǎn)。結(jié)果表明，海藻酸鈉殼聚糖包埋法固定化細(xì)胞的產(chǎn)殼聚糖酶活性較高且穩(wěn)定性好；海藻酸鈉殼聚糖吸附包埋固定化殼聚糖酶的酶比活力、酶結(jié)合效率與酶活力回收率均為最高，且穩(wěn)定性強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：固定化技術(shù)；殼聚糖；殼聚糖酶（Chitosanase， EC3.2.1.99）；海藻酸鈉

中圖分類號(hào)：Q556+.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）21-5282-03

Application of Immobilization Technique in Producing Chitosanase

YUAN Jian-ping，HOU Xiao-qiang

（College of Life Science， Langfang Normal University， Langfang 065000，Hebei， China）

Abstract： Chitosanase production was optimized through evaluating three methods of cells immobilization using the activity and stability of enzyme production as indicators. Four methods of enzyme immobilization were evaluated using of the enzyme combination efficiency， enzyme activity recovery and enzyme stability as indicators. The results showed that the sodium alginate and chitosan embed method was the optimal method of cells and enzyme immobilization due to its best performance in the activity and stability of enzyme production and in the enzyme activity， enzyme combination efficiency， enzyme activity recovery and enzyme stability.

Key words： immobilization technique； chitosan； chitosanase（EC3.2.1.99）； sodium alginate

殼聚糖酶（Chitosanase，EC3.2.1.99）是一種高效、專一水解殼聚糖制備殼寡糖的酶[1，2]。近年來(lái)，利用專一性殼聚糖酶水解殼聚糖制取殼寡糖已成為甲殼素工業(yè)的研究熱點(diǎn)與前沿[3，4]。目前殼聚糖酶研究多集中于菌種篩選與游離細(xì)胞產(chǎn)酶條件等方面。固定化細(xì)胞與固定化酶技術(shù)對(duì)于提高酶的生產(chǎn)與應(yīng)用效率有重要意義[5，6]。本試驗(yàn)采用多種方法對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶菌種及殼聚糖酶固定化進(jìn)行研究，旨在篩選最適固定化細(xì)胞及固定化酶的方法。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

殼聚糖 （脫乙酰度≥80%，濟(jì)南海得貝海洋生物工程公司），海藻酸鈉（黏度范圍：1.05～1.15，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心），乙酸、NaOH、甲醇、戊二醛、HCl、NaCl、CaCl2等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

產(chǎn)殼聚糖酶菌株Yg，廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存提供。改良PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖30 g，蛋白胨2 g，KH2PO4 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，維生素B1 10 mg，蒸餾水1 000 mL，115 ℃高壓滅菌30 min[7]。產(chǎn)酶培養(yǎng)基：KCl 5 g，NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 5 g，K2HPO4 0.75 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g， 蛋白胨8.5 g， 牛肉膏0.25 g，殼聚糖 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5～8.0，121 ℃高壓滅菌30 min[8]。

1.3 方法

1.3.1 固定化細(xì)胞產(chǎn)殼聚糖酶 將Yg菌株于改良PDA斜面上活化2次，而后接種于改良PDA液體培養(yǎng)基，36 ℃、180 r/min培養(yǎng)16 h，再用0.75%無(wú)菌生理鹽水5 000 r/min離心洗滌2次，每次20 min，取菌體沉淀4 ℃保藏備用。采用3種方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定化處理：①海藻酸鈉包埋法。取2.5%海藻酸鈉溶液50 mL，加入2 g濕菌體，攪拌混勻，用8號(hào)針頭從離液面10 cm高處將其滴入2% CaCl2溶液中，濾出凝膠小球，重新置于2% CaCl2溶液中，4 ℃靜置硬化2 h[9]。②海藻酸鈉殼聚糖包埋法。2.5%海藻酸鈉溶液中加入1%的殼聚糖，配制海藻酸鈉殼聚糖膠體溶液。取該溶液50 mL，加入2 g濕菌體，攪拌混勻，用8號(hào)針頭從離液面10 cm高處將其滴入2% CaCl2溶液中，濾出凝膠小球，重新置于2% CaCl2溶液中，4 ℃靜置硬化2 h[10]。③殼聚糖吸附法。將2.5%殼聚糖膠體溶液用8號(hào)針頭滴入凝結(jié)液（20%甲醇和30%NaOH）中，作用2 h后得到中空殼聚糖球，取出用去離子水洗滌，而后放入Yg菌懸液中，吸附2 h，取出殼聚糖球并用0.75%無(wú)菌生理鹽水洗滌后備用[11]。

將各試驗(yàn)組固定化菌體小球放入改良PDA液體培養(yǎng)基中，36 ℃、120 r/min 預(yù)培養(yǎng)12 h，而后放入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min 培養(yǎng)24 h。過(guò)濾取濾液于5 ℃、5 000 r/min離心15 min，取上清液即為粗酶液并測(cè)定其酶比活力。將產(chǎn)酶后的小球過(guò)濾回收，去離子水洗滌后再次產(chǎn)酶，觀察固定化細(xì)胞的重復(fù)利用性能[12，13]。

1.3.2 殼聚糖酶的固定化 取上試驗(yàn)中所得殼聚糖酶粗酶液，利用4種方法分別對(duì)其進(jìn)行固定化處理：①殼聚糖吸附法。3%的殼聚糖膠體溶液，用8號(hào)針頭將其滴入凝結(jié)液（20%甲醇和30%NaOH）中，作用2 h后得中空殼聚糖球，取出后用去離子水洗滌3次，吸水紙吸干。加入殼聚糖酶液至剛好沒(méi)過(guò)球，吸附3 h，取出后去離子水洗滌，收集剩余酶液及洗液并測(cè)定其體積，稱量殼聚糖球質(zhì)量[14]。②殼聚糖交聯(lián)后吸附法。按①法制備殼聚糖球，而后將其加入1%戊二醛溶液中，室溫交聯(lián)6 h，去離子水洗滌、吸干。殼聚糖酶吸附方法同①[14]。③酶先交聯(lián)后殼聚糖吸附法。按①法制備殼聚糖球，取5 mL殼聚糖酶液與0.1 mL 1%戊二醛溶液混勻，作用1 h后加入殼聚糖球，溶液沒(méi)過(guò)球即可，3 h后取出，用去離子水洗滌，收集剩余酶液及洗液并測(cè)定其體積，稱量該殼聚糖球質(zhì)量[15]。④海藻酸鈉殼聚糖吸附包埋法。取含5%海藻酸鈉、2%殼聚糖的海藻酸鈉-殼聚糖膠體溶液5 mL與等量的殼聚糖酶液混勻，用8號(hào)針頭從離液面10 cm處將其滴加到2%CaCl2溶液中。濾出凝膠小球，重新置于2% CaCl2溶液中4 ℃靜置硬化2 h，濾出凝膠小球用去離子水洗滌，收集前后CaCl2溶液及洗液并測(cè)定其體積，稱量該凝膠小球質(zhì)量[14]。

測(cè)定各試驗(yàn)組固定化殼聚糖酶的酶比活力，計(jì)算酶結(jié)合效率及酶活力回收率。過(guò)濾回收初次反應(yīng)后固定化酶小球，去離子水洗滌后重復(fù)反應(yīng)，觀察固定化殼聚糖酶回收及重復(fù)利用效率。

1.4 酶活力測(cè)定及計(jì)算方法

殼聚糖酶活力測(cè)定：將酶液與3%殼聚糖溶液分別預(yù)熱至45 ℃，取5 mL酶液加入50 mL 3%殼聚糖溶液中，混勻并于45 ℃、180 r/min條件下作用，定時(shí)取出反應(yīng)液，加1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至8.0，沸水浴15 min終止反應(yīng)，離心取沉淀于105 ℃烘干至恒重，稱量并計(jì)算酶活。酶活力單位定義：每1 min降解1 μg不溶性的殼聚糖為可溶性殼聚糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位[8]。

洗液中殼聚糖酶活力測(cè)定方法同上；固定化殼聚糖酶活力測(cè)定時(shí)，以固定化殼聚糖酶取代酶液，其余方法同上。

殼聚糖酶液酶比活力=每毫升殼聚糖酶液中所含有的酶活力單位數(shù)（U/mL）

固定化殼聚糖酶酶比活力=每克干燥的固定化殼聚糖酶中所含有的酶活力單位數(shù)（U/g）[16]

酶結(jié)合效率=（原酶液總活力-未固定酶活力）/原酶液總活力×100%[16]。其中原酶液總活力為用于固定化的粗酶液中殼聚糖酶的活力總和，未固定酶活力為固定化處理后剩余酶液及洗液中殼聚糖酶活力總和。

酶活力回收率=固定化酶活力/原酶液總活力×100%[16]。其中固定化酶活力為固定化處理后所得固定化殼聚糖酶的活力總和。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法固定化細(xì)胞產(chǎn)酶活力及回收利用性能比較

3種方法固定化細(xì)胞產(chǎn)酶活力及回收利用性能測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，殼聚糖吸附法固定化細(xì)胞第一次產(chǎn)酶活力最強(qiáng)， 但是2次產(chǎn)酶活力差異極大，且固定化小球的機(jī)械強(qiáng)度差，穩(wěn)定性也不高，很難再重復(fù)利用。海藻酸鈉殼聚糖包埋法固定化細(xì)胞第一次產(chǎn)酶活力略低于殼聚糖吸附法，2次產(chǎn)酶活性穩(wěn)定，且固定化小球機(jī)械強(qiáng)度很高，菌體泄露少，重復(fù)性好。綜合比較，選擇海藻酸鈉殼聚糖包埋法為最優(yōu)固定化細(xì)胞方案。

2.2 不同方法固定化殼聚糖酶性能比較

各種方法所得固定化酶的性能結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，海藻酸鈉殼聚糖吸附包埋法所得固定化殼聚糖酶酶比活力、酶結(jié)合效率與酶活力回收率均為最高，且重復(fù)利用過(guò)程中酶活力損失少，固定化酶的機(jī)械強(qiáng)度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，為最佳固定方法。

3 小結(jié)與討論

殼聚糖是產(chǎn)殼聚糖酶的誘導(dǎo)物，在固定化細(xì)胞過(guò)程中加入殼聚糖可明顯提高產(chǎn)酶性能，但是單純應(yīng)用殼聚糖進(jìn)行固定化的機(jī)械強(qiáng)度差；固定化殼聚糖酶的過(guò)程中，殼聚糖吸附法對(duì)酶活力影響小，但酶的結(jié)合效率較低且重復(fù)性差，戊二醛交聯(lián)則明顯影響了殼聚糖酶的活性。綜合分析認(rèn)為，海藻酸鈉殼聚糖包埋法為最優(yōu)固定化細(xì)胞產(chǎn)殼聚糖酶方案。海藻酸鈉殼聚糖吸附包埋法為固定化殼聚糖酶的最佳方法。

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