大洪山地區(qū)蛹蟲草的分離馴化與鑒定

摘要：以大洪山地區(qū)野生蛹蟲草（Corddcps militaris Link.）為母本篩選優(yōu)良菌種。結(jié)果表明，菌種D1、D3、D4平板培養(yǎng)性能較佳，菌絲致密健壯、氣生菌絲少、匍匐狀、轉(zhuǎn)色快，轉(zhuǎn)色深；菌種D1栽培產(chǎn)量最高達(dá)17.8 g/瓶，草體形態(tài)典型。菌種D1可作為大洪山本地優(yōu)良菌種之一進(jìn)行馴化。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草（Corddcps militaris Link）；分離馴化；鑒定；大洪山

中圖分類號：S567.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5248-03

Isolation， Domestication and Identification of Cordyceps Militaris Link. from Dahongshan Region

FANG Hua-zhou

（College of Biotechnology， Jingchu University of Technology， Jingmen 448000， Hubei， China）

Abstract： The experiment was carried out to screen excellent strains from wild Cordyceps militaris Link. in Dahongshan region. Results showed that the strain D1， D3 and D4 had good characteristics in the plate cultivation， compact and robust hyphae， procumbent， little aerial hyphae， color turned fast and dark. The yield of strain D1 was up to 17.8 g per bottle with typical grass performance and regarded as one of the excellent strains.

Key words： Cordyceps militaris Link.； sepration and domestication； identification； Dahongshan region

蛹蟲草（Corddcps militaris Link.）又名北冬蟲夏草、北蛹蟲草等，為冬蟲夏草近緣種，屬麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Corddceps Link）模式種，在我國分布廣泛[1，2]。研究證實，蛹蟲草營養(yǎng)豐富，具有與冬蟲夏草相同或相似的功能及活性成分，蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖、超氧化物歧化酶（SOD）、腺苷等含量接近或高于天然冬蟲夏草，對消除疲勞、緩解緊張、提高人體免疫力、預(yù)防和治療慢性支氣管炎、肝炎、高血壓、心腦血管疾病、腎炎腎衰、性功能障礙等具有良好的功效，被譽(yù)為蟲草屬真菌后起之秀，是冬蟲夏草的理想替代品[1-5]。近年來，經(jīng)我國科研人員多年努力，我國在世界上率先實現(xiàn)蛹蟲草人工種植，目前已基本實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[4，5]。研究和開發(fā)本地蛹蟲草資源具有廣闊的經(jīng)濟(jì)及市場前景。筆者在湖北省大洪山地區(qū)采集多株蛹蟲草標(biāo)本，并進(jìn)行了分離馴化及栽培試驗，現(xiàn)將有關(guān)情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

野生蛹蟲草采集于湖北省大洪山風(fēng)景區(qū)寶峰山下一處緩坡密林中，寄主昆蟲及子實體基本完整，經(jīng)鑒定為大洪山本地野生蛹蟲草菌株。

馬鈴薯（市場購買）、蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)公司）、葡萄糖（化學(xué)純，天津福晨化學(xué)試劑廠）、瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)公司）、磷酸二氫鉀（化學(xué)純，天津凱通化學(xué)試劑公司）、硫酸鎂（化學(xué)純，天津凱通化學(xué)試劑公司）、維生素B1（藥店購買，湖北華中藥業(yè)公司）；250B型生化恒溫培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠），LRH-250-GSII型微電腦人工氣候箱（廣東省醫(yī)療器械廠），F(xiàn)A2104型分析電子天平（上海良平儀器有限公司），SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），30 W移動式紫外滅菌燈（武漢延安醫(yī)療器械廠），TP22型普通搖床（中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠），DX-400A型高壓蒸汽滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

改良PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.8 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH自然（實測值約6.5）；PDA液體培養(yǎng)基：可溶性淀粉30 g，葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂2 g，維生素B110 mg，水1 000 mL，pH 6.5；栽培岀草培養(yǎng)基：大米30 g，營養(yǎng)液45 mL。其中營養(yǎng)液配方：蠶蛹粉10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.8 g，維生素B110 mg，水1 000 mL，pH 7.5。各培養(yǎng)基[6-10]按常規(guī)方法配制，分別作為試管斜面、固體平板或液體培養(yǎng)基。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種分離 野生蛹蟲草流水洗去泥土，無菌水漂洗3～5次，取其子實體上半部分，以0.1%升汞溶液處理30 s、無菌水漂洗，以組織分離法切取1～2 mm大小組織塊，轉(zhuǎn)接至改良PDA試管斜面，適宜溫度培養(yǎng)，分離制備菌種[8，9]。

1.3.2 菌種性能與篩選 從各試管菌種挑取約1 mm大小菌種塊，分別接種至改良PDA平板培養(yǎng)基，適溫黑暗培養(yǎng)5 d后光照培養(yǎng)5 d，比較觀察各菌種菌株生長速度、菌絲形態(tài)、光照轉(zhuǎn)色能力、光照培養(yǎng)菌絲形態(tài)等，選取菌絲長勢好、健壯、轉(zhuǎn)色快、轉(zhuǎn)色深的菌株為初篩菌種。將初篩菌種轉(zhuǎn)擴(kuò)為液體菌種，按常規(guī)方法進(jìn)行栽培試驗，以實際栽培產(chǎn)量和草體形態(tài)為主要指標(biāo)確定適宜菌種，并結(jié)合栽培過程全面檢驗和驗證菌種性能[10]。上述試驗各菌種菌株均5個以上重復(fù)，栽培出草20瓶重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離結(jié)果

共選取了6只野生蛹蟲草為母本，各寄主均為鱗翅目昆蟲幼體或蛹體，子實體形態(tài)較為典型，黃色至橘紅色，直徑3～4 mm、長3.5～5.0 cm，子實體經(jīng)組織分離后制備菌種依次記為D1、D2、D3、D4、D5、D6；剔除遭感染試管，共成功分離37支菌種試管；其中D1試管9支、D2試管4支、D3試管6支、D4試管5支、D5試管6支、D6試管7支。

2.2 菌種培養(yǎng)性狀與初篩結(jié)果

將菌種轉(zhuǎn)接至平板培養(yǎng)基，模擬菌絲生長主要實際過程，觀察其生長及發(fā)育情況。閉光培養(yǎng)可反映菌絲營養(yǎng)生長情況；見光培養(yǎng)可反映菌絲轉(zhuǎn)色、出草等生殖生長情況[1，3]。試驗結(jié)果見表1。

從表1可以看出，各菌種生長均較為迅速，菌絲潔白、健壯、致密，氣生菌絲較少，轉(zhuǎn)色能力亦較強(qiáng)。分析其原因，各菌種均由原始母本直接組織分離制備，可良好遺傳母本菌絲生長、轉(zhuǎn)色乃至出草性能所致。菌絲生長快、健壯、氣生菌絲少、匍匐狀，則菌絲易于深入培養(yǎng)基內(nèi)部，吃料迅速、營養(yǎng)充分，可為菌絲進(jìn)入生殖生長奠定良好的營養(yǎng)及物質(zhì)基礎(chǔ)；轉(zhuǎn)色快、轉(zhuǎn)色深、顏色典型是菌絲良好的生長發(fā)育及進(jìn)入生殖生長、具有良好生長性能的重要標(biāo)志，是菌絲扭結(jié)出草的重要和關(guān)鍵步驟[1，3，10]。菌絲生長快、健壯致密、氣生菌絲少、轉(zhuǎn)色能力強(qiáng)，是優(yōu)良蛹蟲草菌種菌絲必須具備的重要基本性能[11，12]。進(jìn)一步比較各菌種生長及發(fā)育狀況，菌種D1生長速度最快，達(dá)4.38 mm/d，與其他菌種生長速度差異顯著（P<0.05）；閉光培養(yǎng)菌絲潔白健壯、致密、長勢好，氣生菌絲少，匍匐狀，見光培養(yǎng)菌絲致密、轉(zhuǎn)色快、顏色深、橘黃色，表明其培養(yǎng)性能最優(yōu)；菌種D3、D4次之，菌絲長勢較好、生長較快、氣生菌絲較少、轉(zhuǎn)色較深，本試驗將D1、D3、D4作為初選菌種。試驗中還觀察到各菌種試管斜面菌絲均表現(xiàn)致密健壯潔白匍匐狀，生長性狀差異不顯著，可能與試管斜面面積較小有關(guān)。

2.3 栽培試驗與復(fù)篩結(jié)果

栽培試驗是檢驗菌種性能的根本方法，是鑒定和篩選菌種是否具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的主要依據(jù)[10]。將菌種D1、D3、D4轉(zhuǎn)擴(kuò)為液體菌種，按常規(guī)方法進(jìn)行栽培試驗，試驗結(jié)果見圖1及表2。

從圖1可以看出，D1子座較多、生長趨勢好，草體形態(tài)最典型；D3次之，子座略呈彎曲狀、少數(shù)有分叉；D4子座過多、分叉、叢枝狀，生長趨勢弱，形態(tài)最差。對照表2可以看出，菌種D1生長迅速、轉(zhuǎn)色快，產(chǎn)量最高，平均鮮重達(dá)17.8 g/瓶，已接近一般蛹蟲草種植水平，說明菌種D1具有良好的生產(chǎn)性能。對栽培過程中菌絲生長情況進(jìn)行分析，菌種D1菌絲萌發(fā)快、料面氣生菌絲少、吃料迅速，菌絲滿瓶時間短，菌絲致密、轉(zhuǎn)色快、轉(zhuǎn)色深，完成轉(zhuǎn)色后約7～8 d子座即開始萌出，均快于其他試驗組；對照表1及原始母本情況，D1母本形態(tài)典型、生命力旺盛、子實體較長且粗壯，平板培養(yǎng)健壯致密、生長迅速、氣生菌絲少、轉(zhuǎn)色快、轉(zhuǎn)色深，說明菌種D1已遺傳和保持母本優(yōu)良性能，可作為實際生產(chǎn)用種。試驗中，菌種D3滿瓶時間較長、料面氣生菌絲較少、轉(zhuǎn)色較快、產(chǎn)量較高，菌種D4滿瓶時間較短、料面氣生菌絲較多、轉(zhuǎn)色時間較長、較淡、萌出芽體較多、草體短小、分叉、產(chǎn)量低。從生長過程分析，氣生菌絲少，菌絲迅速深入培養(yǎng)基內(nèi)部，吸收營養(yǎng)充分，因而轉(zhuǎn)色快，產(chǎn)量高，顯然與菌種之間的性能差異有關(guān)。

3 小結(jié)

菌種性能在蛹蟲草栽培過程中起著決定性作用。目前，組織分離法和子囊孢子分離法是蛹蟲草菌種分離與制備的兩種常用方法。子囊孢子分離法因存在減數(shù)分裂及配對過程，變異較大，多用于優(yōu)良菌種選育及菌種復(fù)壯；組織分離法為無性繁殖方式，多用于優(yōu)良母本菌種的分離繁殖。本試驗以子實體組織分離法從本地多株野生蛹蟲草中篩選出菌種D1，人工栽培性能良好，其草體形態(tài)和產(chǎn)量具有較高商品價值，具有良好的應(yīng)用前景。鑒于我國地域多樣性，需在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開展其功能活性成分及深加工研究，以促進(jìn)本地蟲草資源良性發(fā)展。

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