內生枯草芽孢桿菌QZ—8對茄子的抗病促生作用

摘要：茄子黃萎病是嚴重影響茄子產量的土傳病害。為了有效控制該病害，從開花期茄子根莖中分離得到對黃萎病菌具有強烈抑制作用的內生生防菌株QZ-8，其抑菌直徑達24 mm，經16 S rDNA序列分析確定其為枯草芽孢桿菌。室內定殖試驗表明，QZ-8菌株能順利定殖于茄子根際和維管束中，最高定殖量可達1×105 CFU/g茄組織。另外QZ-8菌株可促進茄種子的萌發(fā)、茄子幼苗及根系生長。室內盆栽試驗表明，QZ-8對茄子黃萎病均具有很高的防效，可達78.98%，持效期較長。

關鍵詞：茄子黃萎??；內生菌；定殖；拮抗

中圖分類號：S432.4 文獻標識碼： A 文章編號：0439-8114（2013）21-5199-04

Roles of the Endogenous Bacillus Subtilis QZ-8 on the Disease Resistance and Promoting Growth of Eggplant

LU Hong-xue，YANG Ting-xian，YANG Pei，SUN Zheng-xiang， ZHOU Yi

（College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China）

Abstract：Eggplant Verticicillium wilt is a soil-borne disease which can result in great loss of the yield. To control this disease， endophytic antagonistic bacteria were collected in the flowering stage of eggplant. An antagonistic strain with the inhibition diameter 24 mm was isolated from the stem of eggplant. The 16 S rDNA sequence of the strain QZ-8 shares 99.0% sequence homology with that of Bacillus subtilis. Therefore， the strain is named B. subtilis QZ-8. The indoor colonization test showed that the strain QZ-8 could enter the eggplant and the number could reach 1×105 cfu/g. The strain QZ-8 can promote the germination of the eggplant seed and the growth of root and stem. The pot experiments showed that controlling effects of strain QZ-8 on eggplant wilt could be up to 78.98%.

Key words： eggplant wilt； Verticillium dahlia； Bacillus subtilis； colonization； control effect

茄子黃萎病是嚴重威脅其產量的一種土傳維管束病害，由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb）引起，俗稱半邊瘋、黑心病。該病原菌可以微菌核的形式在植物衰老組織中存活數年并保持侵染能力[1]，在土壤中能存活14年或更長時間[2]，因此該病極難防治。

化學農藥對茄子黃萎病的防治效果不理想。一方面，由于病菌主要從根部侵入，土壤的吸附和降解能力很強，農藥進入土壤很難殺死土壤中的病菌；另一方面，由于農藥內吸傳導性差，不能從植物地上部分進入并有效地控制進入作物維管束內的病原菌。選育和種植抗病品種是防治這類病害的最有效途徑，但目前我國栽培品種中缺乏抗黃萎病的種質資源[3]，水旱輪作能有效控制該病害的發(fā)生，但由于我國耕地面積的限制，這一措施很難實施。因此，對于這類病害目前還沒有很有效的防治措施。

拮抗菌成為近年來的研究熱點，內生菌更是其中的一個研究方向。內生細菌能定殖于植物體內，部分還具有促生、抗病和固氮等功能，是重要的生物防治資源。由于內生菌具有高效定殖能力，將在土傳病害、維管束病害的防治方面具有較好的應用前景。本研究從茄子根莖部篩選到對黃萎病菌具有強拮抗作用的QZ-8菌株，對其定殖和防病功能進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種和品種

茄子黃萎病原菌（Verticillium dahliae）由長江大學農學院植物病理實驗室提供，茄子品種為三月茄。

1.2 主要培養(yǎng)基

PSA培養(yǎng)基：用于病原菌的培養(yǎng)。篩選培養(yǎng)基：分別稱取新鮮茄子根100 g、蔗糖5 g、蛋白胨5 g、酵母浸出粉2 g和瓊脂15 g。將100 g茄子根用適量去離子水煮沸10 min，過濾，取過濾液，在濾液中添加蛋白胨、蔗糖和酵母粉，煮沸，最后加入瓊脂，定容至1 000 mL，調節(jié)pH 6.5～7.0，分裝滅菌后用于篩選和培養(yǎng)茄子內生菌。

1.3 內生菌芽孢桿菌的初級分離

在茄子開花期，選取茄子黃萎病發(fā)生嚴重的田塊，挑選長勢好的健康茄子植株，取其根莖部，去皮、自來水洗凈、分別用75%酒精消毒5 min，0.1%升汞消毒2 mim，去離子水漂洗3次后剪碎并加入去離子水，在25 ℃下浸泡24 h（使維管束中的內生菌充分游離出來）；于恒溫水浴鍋中加熱處理到至80 ℃，計時20 min（除去非芽孢桿菌），取液體30 μL涂平板，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待其長出菌落，挑選芽孢桿菌及類似菌落，進行抑菌活性檢測。

1.4 內生菌的抗菌活性篩選

初篩：取病菌移接到裝有30 mL PSA液體培養(yǎng)基的三角瓶（100 mL）中， 25 ℃，150 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，吸取1mL病原菌溶液，注入45 ℃左右的PSA培養(yǎng)基（200 mL）中，混勻后倒平板，即得到含病原菌培養(yǎng)基。將分離所得菌株編號，分別在含菌培養(yǎng)基稀釋劃線后，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，選擇菌落周圍抑菌圈明顯的菌株，保存?zhèn)溆?。復篩：制備含病菌平板（方法同初篩），在平板中用打孔器打直徑5 mm的4個孔（3個孔為處理組，1個孔為對照），用少許融化培養(yǎng)基封住孔底。將初篩內生菌的發(fā)酵液于4 ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，吸取100 μL注入待測平板孔里，以去離子水作為對照，以抑菌帶寬度大小判定生防菌株的抑菌活性強弱，篩選出抑菌能力強的菌株。

1.5 QZ-8菌株對馬鈴薯的致病性測定

對復篩后表現較強抑菌活性的QZ-8菌株進行致病性測定：將馬鈴薯洗凈，表面用75%的酒精消毒2 min，無菌水沖洗3次，切成薄片，放于含濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內，接30 μL內生菌發(fā)酵液于馬鈴薯片，對照加清水；25 ℃恒溫培養(yǎng)，48 h后檢測致病性。

1.6 QZ-8菌株對茄子萌發(fā)、幼苗生長的的影響

1）QZ-8菌株發(fā)酵液浸泡茄子種子1 d（對照用自來水），在培養(yǎng)皿內放濕潤濾紙，將浸泡后的種子轉移到培養(yǎng)皿內，每皿10粒種子，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察種子萌發(fā)情況及生長情況。

2）取茄子地土樣，121 ℃高壓蒸汽滅菌，待冷卻后將內生菌發(fā)酵液（4×108 cfu/mL）與土樣混合（按50 mL/kg比例混合），分裝于花盆中，設3次重復；將催芽后種子播種于花盆內，以不加內生菌的為CK1，加內生菌QZ-5菌株的為CK2，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7 d后記錄出芽率，30 d比較根系及地上部分生長狀況。

1.7 QZ-8菌株在田間土壤中的數量動態(tài)變化

1）內生菌抗生素標記：通過對試驗菌株進行天然耐藥性檢測的結果選擇抗生素種類，本試驗中，確定用氨芐西林作為QZ-8菌株的抗生素標記。在含標記藥物的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)，直至確定菌株具有穩(wěn)定的耐藥性（QZ-8對氨芐西林的耐藥濃度達200 μg/mL）后進行植株內定殖試驗。

2）將QZ-8菌株（4×108 cfu/mL）發(fā)酵液與茄子田塊土樣混合（按50 mL/kg比例），分裝在花盆中，每處理設3次重復。將花盆下部埋于田間，只留盆口暴露于地面，以不加QZ-8菌液的相同田塊土壤作為對照。于5、10、20、30、40、50、60 d分別取樣，采用稀釋平板法測量經標記的QZ-8在土壤中的存活數量，為菌株的田間應用可行性提供依據。

1.8 QZ-8菌株在植株中的定殖

將茄子地土樣滅菌，裝缽（每缽裝2.5 kg土壤）后播種，每缽5粒種子，在光照12 h，28 ℃，濕度80%和黑暗12 h，24 ℃，濕度80%的變溫條件下培養(yǎng)；待茄子長出2～3心葉時取已做標記的QZ-8菌液（1×108 CFU/mL）澆灌于茄子根部，每株澆菌液10 mL，以不接菌的為對照，每個處理5缽，設3次重復。

在處理后的10、20、30、40、50 d，分別測定菌株的定殖情況：取植株根部及近地莖桿，去皮后稱重，表面消毒，充分剪碎，于25 ℃下用10 mL無菌水浸泡24 h后，取浸泡液稀釋后涂平板（篩選培養(yǎng)基，含氨芐西林200 μg/mL），計算茄子維管束中的菌含量（CFU/g）。

1.9 盆栽防治試驗

盆栽土的制備：先將茄子地土壤與營養(yǎng)土，按50∶50（質量比）比例混合，然后按1 mL/kg比例接入黃萎病菌（50 cfu/mL孢子懸浮液），充分混勻后分裝于花盆中，以不接病菌的為對照。育苗后移栽，并且每株澆QZ-8菌液（1×108 CFU/mL）10 mL，每處理設3次重復；澆灌后30、45、60 d調查發(fā)病率和病情指數。

防效=（對照組病情指數-處理組病情指數）/對照組病情指數×100%

病情指數=[∑（病級株數×代表數值）/（總株數×發(fā)病最重級的代表數值）]×100%

2 結果與分析

2.1 內生菌的分離與篩選

經分離純化后共得到210株細菌菌株。采用平板劃線法初篩得到18株抑菌活性較強的菌株，篩選率為8.6%；復篩結果顯示其中抑菌效果較好的菌株QZ-8，抑菌帶寬達24.00 mm，而對照不表現抑菌活性（圖1）。

2.2 QZ-8菌株對馬鈴薯的致病性及其對茄子萌發(fā)、幼苗生長的影響

1）初步致病性檢測結果表明，QZ-8對馬鈴薯無致病性，如圖2所示。

2）試驗結果表明，各處理與對照之間的出芽率沒有明顯的區(qū)別，均為90%左右，但經QZ-8菌株處理后的茄子種子在第3天開始發(fā)芽，而對照直到第5天時開始陸續(xù)發(fā)芽；QZ-8菌株處理后7 d的種子幼苗根系比對照明顯伸長，長度為15～35 mm，而對照根系長僅有6～10 mm，如圖3、圖4所示。

3）經QZ-8菌株處理后的茄子幼苗，在第30天調查時，發(fā)現其長勢旺于對照，如圖5、圖6所示。處理的平均株高達到25.26 cm，對照僅為15.45 cm；植株根系發(fā)達，葉色濃綠，平均須根數目為96根，而對照為20根；植株莖的平均直徑為0.54 cm，對照為0.38 cm。

2.3 QZ-8菌株在田間土壤中的含量變化

試驗結果如圖7所示。QZ-8菌株含量在接菌后0～10 d期間持續(xù)下降，之后維持10 d左右的穩(wěn)定期，其含量逐漸上升，第50天達到最高含量（3.2×105 CFU/g，此值與最初加入的菌含量相當）；隨后又開始下降，但至60 d時仍有2.3×104 CFU/g的菌含量。對照則一直保持較低含量水平（1 000 CFU/g以下）。說明內生拮抗菌株QZ-8在土壤中適應一段時間后能夠繼續(xù)增殖。

2.4 QZ-8菌株在植株中的定殖情況

QZ-8菌株在植株中的定殖情況如圖8所示。從各處理的茄子根部維管束中均分離出了抗氨芐西林的細菌，且菌含量呈上升趨勢，在30 d左右達到高峰（3.1×105 CFU/g），之后緩慢下降，但在50 d時仍有2.7×105 CFU/g。對照處理只有少量抗氨芐西林菌落，含量在1 000 CFU/g以下。

2.5 盆栽試驗

盆栽試驗結果如表1所示。經QZ-8菌株處理后的茄子發(fā)病率和病情指數一直保持較低水平，平均發(fā)病率21.67%，平均病情指數10.42%，其防效可達到78.98%；而對照的平均發(fā)病率和平均病情指數分別達到79.44%和49.97%。且經QZ-8菌株處理的茄子植株發(fā)病率和病情指數隨植株生長發(fā)育均保持相對穩(wěn)定，而對照處理均有不斷加劇的趨勢。

3 討論

植物內生菌是一個多樣性的微生物類群，已受到各國微生物界的高度關注。研究表明，植物內生菌在體內占據有利于生防的生態(tài)位，具有生物防治，促進植物生長，增強宿主抗逆境、抗病蟲害、抗菌、抗病毒和抗腫瘤活性等優(yōu)點[4-6]。本研究從茄子根莖維管束內篩選得到抑菌活性較強的菌株QZ-8，不僅在PSA平板上對茄子黃萎病菌表現出很高的活性，而且經過致病性測定以及對茄子萌發(fā)與幼苗生長是否有影響的測試試驗表明，該菌株對茄子安全，無副作用，并且還具有較強的促生作用。

對菌株在田間含量變化試驗表明，QZ-8在田間狀態(tài)下能長期存活（60 d）且保持較高菌含量。處理后前10 d的菌含量下降說明菌株本身對周圍環(huán)境有一個適應過程，待穩(wěn)定后其菌群含量又呈上升趨勢，并達到峰值。這說明在一定的時空范圍內，菌株喜好土壤中的某些營養(yǎng)因子，能利用其進行短時間的大量繁殖，隨著時間的推移，營養(yǎng)因子消耗殆盡，菌群含量又表現出下降趨勢，但在處理第60天菌含量仍然可達2.7×104 CFU/g，說明該菌株能在土壤中存活較長時間。目前的研究已有關于內生菌在茄子體內的定殖消長動態(tài)的報道[7-10]，但少見相關的田間含量變化的報道。

QZ-8菌株定殖于茄子維管束內，數量也呈現先增后減的趨勢，持續(xù)時間較長。這與前人報道的結果不大一樣：居正英等[7]研究顯示，菌株29-12在茄子根內11 d就檢測不到標記菌株；吳藹民等[8]研究表明，內生菌73a在不同抗性棉花品種內的定殖也呈現由增到減的趨勢，但定殖時間也在10 d左右；陳利軍[9]研究表明，SC-bYM3-1內生菌在油菜內定殖后28 d仍能分離到（6.6×103 cfu/g）。分析認為，這可能與菌株的種類和定殖能力有關。其次，在不同的生育期內，其體內會發(fā)生相應的生理變化，其內生菌的種群結構也會發(fā)生相應的變化。這一點與很多研究報道相符[10-12]。盆栽試驗結果顯示，QZ-8菌株對茄子黃萎病具有很高的防效，達到78.98%，且發(fā)病率和病情指數保持相對穩(wěn)定，也可以說明QZ-8菌株對茄子黃萎病具有較穩(wěn)定的控制作用。

因此，該菌株是一個能有效定殖于茄子根部、并且較長時間存活于田間土壤的內生拮抗菌，具有進一步開發(fā)成生防菌劑的價值；目前關于該菌株活性成分物質的鑒定、分類地位、定殖機理、田間最佳定殖濃度以及在田間繁殖的影響因子等正在研究中。

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