幾株硅酸鹽細菌菌株的分離及解鉀、解硅活性

摘要：從水稻田和玉米田土樣中分別分離適用于水田作物和旱田作物的硅酸鹽細菌，對能夠在亞歷山大羅夫培養(yǎng)基上生長且符合硅酸鹽細菌菌落特征的細菌菌株進行菌種鑒定，然后測定在不同供氧條件下菌株的解硅、解鉀能力。結(jié)果表明，從水稻田土樣中分離得到菌株2株，從玉米田土樣中分離得到菌株1株，經(jīng)鑒定均屬于硅酸鹽細菌的一種——膠凍樣類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）。在不同供氧條件下，這3株菌株均具有一定的解硅、解鉀活性，供氧充足的條件下菌株h-5的解硅活性最高，可以使發(fā)酵液中水溶性硅含量達到4.5 μg/mL以上，菌株s-4解鉀活性最高，可以使水溶性鉀含量達到46.73 mg/L以上。分離自水田的2株菌株在微氧條件下仍能保持較高的解硅、解鉀活性，具有作為生物肥料的出發(fā)菌株應(yīng)用于水田作物的較大潛力。

關(guān)鍵詞：硅酸鹽細菌；分離；鑒定；解硅活性；解鉀活性

中圖分類號：S154.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5147-06

Isolation of Several Silicate Bacteria Strains and Determination of Their Activity of Releasing Silicon and Potassium

LI Jia，ZHANG Ai-min，WANG Wei，ZHU Bao-cheng

（College of Life Science， Hebei Agricultural University， Baoding 071001， Hebei， China）

Abstract： From the soil samples of paddy field in Hunan area and corn field in Hebei area， several silicate bacteria strains were isolated Then the strains were identified by morphological and culture features observation. The activity of releasing silicon and potassium of these strains on different levels of oxygen dissolution were determined. The results showed that two strains and one strain were obtained from paddy soil and corn field soil， respectively. These three strains were all identified as Paenibacillus mucilaginosus， a kind of silicate bacteria. These three strains had a certain level of activity of releasing silicon and potassium. Among them， strain h-5 had the highest activity of releasing silicon， the content of water soluble silicon in its fermentation broth could reach over 4.5 μg/mL. Strain s-4 had the highest activity of releasing potassium， the content of water soluble potassium in its broth were over 46.73 mg/L. The activity of releasing silicon and potassium of two strains obtained from paddy soil were stabler on different levels of oxygen dissolution than that of other strain. On the condition of low oxygen dissolution， the two strains obtained from paddy soil could still keep a relatively high activity of releasing silicon and potassium.

Key words： silicate bacteria； isolation； identification； activity of releasing silicon； activity of releasing potassium

硅酸鹽細菌（Silicon bacteria）是指能分解硅酸鹽類礦物的細菌[1]。一般認為，硅酸鹽細菌最早是1950年由前蘇聯(lián)學者亞歷山大羅夫從黑鈣土和灰鈣土中分離出來的。目前普遍認為硅酸鹽細菌主要有環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）、膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）和土壤芽孢桿菌（Bacillus edaphicus）3種，近年有學者報道將膠質(zhì)芽孢桿菌和土壤芽孢桿菌分別重命名為膠凍樣類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus）和土壤類芽孢桿菌（Paenibacillus edaphicus），歸入類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），同時也有學者報道分離出假單胞菌和多粘類芽胞桿菌等硅酸鹽細菌， 它們均具有較好的解硅、解鉀能力[2]。有報道表明，硅酸鹽細菌具有分解土壤中的含鉀礦物質(zhì)釋放鉀元素的能力，也能活化硅、磷等多種營養(yǎng)元素供作物吸收利用，增加作物產(chǎn)量，亦有報道稱其具有固氮功能。因此，硅酸鹽細菌作為土壤中的一類重要的功能菌，將其開發(fā)作為生物肥料的有效成分來轉(zhuǎn)化利用土壤中的硅元素和鉀元素等資源，對發(fā)展生態(tài)、經(jīng)濟農(nóng)業(yè)具有十分重要的意義[3-6]。

目前生物肥料在應(yīng)用中存在一些問題，如生物肥料在使用中肥效的發(fā)揮受到許多因素制約，生物肥料菌株在不同作物及土壤環(huán)境中植株根系區(qū)域的定植、生長、繁殖狀態(tài)以及與土壤周圍環(huán)境的相互作用都不盡相同，然而目前報道使用的菌株并沒有考慮到這一點。為此，對從湖南地區(qū)水稻田土壤和河北地區(qū)玉米田土壤中分離得到的3株符合硅酸鹽細菌菌落特征的菌株進行了菌種鑒定，并對其在不同供氧條件下的解硅、解鉀能力進行初步研究，為其作為生物肥料出發(fā)菌株分別用于水田作物和旱田作物提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品 供試土樣：湖南省漣源地區(qū)水稻田土壤；河北省保定地區(qū)玉米田土壤。對照菌株：膠凍樣類芽孢桿菌菌株AC10012，河北眾邦生物技術(shù)有限公司、河北巨微生物工程有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 硅酸鹽細菌發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 12.0 g，CaSO4·7H2O 2.0 g，CaCO3 5.0 g，淀粉 10.0 g，硫酸銨3.5 g，K2HPO4 3.0 g，酵母粉 0.8 g，pH 7.0，去離子水 1 000 mL。亞歷山大羅夫培養(yǎng)基參考《微生物實驗指導》[7]的方法配制。生理生化鑒定培養(yǎng)基參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]的方法配制。

1.1.3 主要試劑 菌種鑒定試劑參見《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]。耗氧劑：密閉培養(yǎng)室每升容積需亞硫酸鈉5.0 g、碳酸氫鈉5.0 g、還原性鐵粉1.0 g、水2.2 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 土樣采集 用接種鏟取田塊中10～15 cm深處土樣，裝于牛皮紙袋中，風干后保存。并記錄采樣時間、地點等信息。

1.2.2 水稻田土樣中菌株的分離純化 取供試土樣1.0 g，加入到含9.0 mL無菌水的試管中，充分振蕩搖勻，靜置后取上清液1.0 mL再加入到另一含9.0 mL無菌水的試管中，按10-3～10-8梯度稀釋，分別從各級土壤稀釋液中各取1.0 mL涂布亞歷山大羅夫培養(yǎng)基平板，將平板置于放有足量耗氧劑的直徑 150 mm的大平皿中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)。5 d后分別挑選符合硅酸鹽細菌菌落形態(tài)的菌株，將選中的菌落輕輕挑起一點穿刺接種到亞歷山大羅夫培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d后置于4 ℃冰箱保存。同時，將所選菌株轉(zhuǎn)接到亞歷山大羅夫培養(yǎng)基上劃線驗純。

1.2.3 玉米田土樣中菌株的分離純化 按“1.2.2”的方法得到各級土壤稀釋液，將其各取0.1 mL涂布亞歷山大羅夫培養(yǎng)基平板，之后將平板置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后挑選符合硅酸鹽細菌菌落形態(tài)的菌株，將選中的菌落輕輕挑起一點轉(zhuǎn)接到亞歷山大羅夫培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d后再置于4 ℃冰箱保存。同時，將所選菌株在亞歷山大羅夫培養(yǎng)基上劃線驗純。

1.2.4 菌落形態(tài)觀察 從活化后的菌株斜面上輕輕刮取少量供試菌株的菌體細胞加到10 mL無菌水中混勻，梯度稀釋分別得到10-2、10-3、10-4、10-5等各級稀釋液。分別取10-4、10-5這兩個稀釋梯度的稀釋液0.2 mL涂布亞歷山大羅夫培養(yǎng)基平板，然后倒置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。待單菌落長出后進行觀察。從水稻田土壤中分離得到的菌株置于放有足量耗氧劑的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.5 菌體特征觀察 挑取在亞歷山大羅夫培養(yǎng)基上活化后的菌株進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)，具體染色方法參見《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]。

1.2.6 菌株的生理生化測定 根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]中有關(guān)屬、種鑒定的內(nèi)容和方法，進行了菌株需氧性測定、二乙酰（VP）試驗、酪素水解試驗、硝酸鹽還原試驗、卵磷脂酶試驗、吲哚試驗、檸檬酸鹽利用試驗、甲基紅試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、淀粉水解試驗、過氧化氫酶試驗、葡萄糖發(fā)酵試驗、甘露醇發(fā)酵試驗、脲酶試驗、明膠液化試驗等。

1.2.7 基因組DNA的提取及16 S rDNA的擴增純化 采用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）[9]提取菌株的基因組DNA。以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。以菌株的基因組DNA為模板測序。

1.2.8 16 S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 利用生物序列的相似性搜索（BLAST）方式將測定的供試菌株的16 S rDNA序列與基因庫（GenBank）中所有已測定的原核生物的16 S rDNA序列進行比較。根據(jù)生物序列的相似性搜索（BLAST）比較的結(jié)果，從基因庫（GenBank）中獲得相應(yīng)菌株16 S rDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。序列比對利用多重序列比對（CLUSTAL X）程序進行，進化距離的計算利用菲利普（Phylip）軟件包中的距離計算（DANDIST）程序進行，進化樹的構(gòu)建利用菲利普（Phylip）軟件包中的臨近距離比對（Neighbor-joing）程序進行，分支模式的重復性利用菲利普（Phylip）軟件包中的序列助手（Seqboot）和序列檢測（Consense）程序分析，生成的樹利用樹視圖（Treeview）程序重建[10]。

1.2.9 在不同溶氧發(fā)酵條件下菌株解鉀活性的測定 在無鉀發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為1.0 g/mL的鉀鋁酸鹽，接種供試菌株，分別在不同供氧條件下進行發(fā)酵，每項3個平行，培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液。

發(fā)酵過程分三組：第一組以透氣膜封口，搖瓶發(fā)酵（180 r/min）；第二組以透氣膜封口，靜置發(fā)酵；第三組以不透氣的塑料膜封口，加耗氧劑靜置發(fā)酵。

取適量發(fā)酵液過濾除去菌體和殘渣，稀釋5倍，利用原子吸收分光光度法測定稀釋液中水溶性鉀含量，在30 min內(nèi)比濁完畢，同時做空白對照試驗[11]。

以河北眾邦生物技術(shù)有限公司、河北巨微生物工程有限公司生產(chǎn)的硅酸鹽細菌菌株AC10012作為對照菌株同時進行發(fā)酵及解鉀活性測定。

1.2.10 在不同溶氧發(fā)酵條件下菌株解硅活性的測定 將供試菌株接種到含1.0 g/L石英砂的發(fā)酵培養(yǎng)液中，分別在不同供氧條件下進行發(fā)酵，每項3個平行，培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液。

發(fā)酵過程分三組：第一組以透氣膜封口，搖瓶發(fā)酵（180 r/min）；第二組以透氣膜封口，靜置發(fā)酵；第三組以不透氣的塑料膜封口，加耗氧劑靜置發(fā)酵。

精確吸取過濾的發(fā)酵液適量于小燒杯中，以硅鉬藍分光光度法[12，13]測定發(fā)酵液中水溶性硅的含量。

以硅酸鹽細菌菌株AC10012作為對照菌株同時進行發(fā)酵及解硅活性測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離到的硅酸鹽細菌菌株

分別從湖南水稻田土樣和河北玉米田土樣分離純化符合硅酸鹽細菌菌落形態(tài)特征的細菌菌株，從水稻田土樣得到菌株2株，分別編號為s-2和s-4，從玉米田土樣得到菌株1株，編號為h-5。

2.2 菌落形態(tài)

供試菌株菌落均為圓形凸起、邊緣完整、表面濕潤光滑、無色透明，玻璃珠狀，菌落黏稠，富有彈性，挑起時能拉成很長的絲。符合典型的硅酸鹽細菌的單菌落特征，菌落形態(tài)見圖1。

2.3 菌體特征

供試菌株經(jīng)革蘭氏染色在顯微鏡下觀察均呈陽性，菌體呈長桿狀，兩端鈍圓，周圍有很肥厚的莢膜（圖2）。

2.4 菌株的生理生化特性

菌株的生理生化試驗結(jié)果見表1。硅酸鹽細菌大多數(shù)為化能異養(yǎng)細菌，能利用蔗糖、葡萄糖、淀粉、甘露醇等多種碳源；最適生長溫度為25～28℃，最適生長pH 7.0～8.5。

通過對供試菌株的菌落形態(tài)、菌體特征的觀察以及生理生化特征測定，根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]中有關(guān)種、屬鑒定的內(nèi)容和方法，初步鑒定這3株供試菌株均屬于類芽孢桿菌屬。

2.5 基因組DNA的提取純化及16 S rDNA序列的擴增測序結(jié)果

將已測供試菌株的16 S rDNA序列與基因庫（GenBank）中所有已測定的原核生物的16 S rDNA序列進行比較，利用菲利普（Phylip）軟件包處理所得數(shù)據(jù)，得到了供試菌株及相關(guān)菌株的進化距離并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。供試菌株的16 S rDNA序列已提交入基因庫（GenBank），得到國際基因庫序列號，s-2為HM849728，s-4為HM849729，h-5為HM849727。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用相關(guān)菌株的16 S rDNA序列登錄號及菌株s-2、s-4、h-5與參比菌株的16 S rDNA序列相似性列于表2。

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，結(jié)合其形態(tài)特征及生理生化特性，初步鑒定以上3株供試菌株均為膠質(zhì)芽孢桿菌，即近年報道的膠凍樣類芽孢桿菌，屬于硅酸鹽細菌的一種。

2.6 在不同溶氧發(fā)酵條件下菌株的解鉀活性

以吸光度為縱坐標，鉀標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程■=0.120 9x-0.145 1，r=0.989 6。

在不同溶氧發(fā)酵條件下進行發(fā)酵，測定對照菌株AC10012及其他各供試菌株的解鉀活性，每項3個平行，取平均值。根據(jù)待測液吸光度的平均值，即可從回歸方程中算得相應(yīng)的鉀元素含量，結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，相對于對照菌株AC10012來說，分離得到的硅酸鹽細菌菌株均具有較高的解鉀活性，其中第一組試驗活性較高的是菌株h-5和菌株s-4，在搖瓶發(fā)酵條件下，可以使發(fā)酵液中水溶性鉀含量分別達到43.65 mg/L和46.73 mg/L，明顯高于對照菌株的解鉀活性，具有開發(fā)作為生物鉀肥有效成分增加作物產(chǎn)量的潛力。另外，在供氧充足的條件下，分離得到的3株供試菌株均表現(xiàn)出較高的解鉀活性，當發(fā)酵體系中溶氧下降，溶氧濃度相對較低時，對照菌株AC10012及分離自玉米田土壤的菌株解鉀能力均受到較大影響，菌株的解鉀活性下降了約50%，而從水稻田土壤中分離得到的硅酸鹽細菌菌株s-2和s-4的解鉀活性相對于對照菌株AC10012和從玉米田土壤中分離得到的菌株h-5來說，受到的影響較小，仍保持較高的解鉀活性，甚至高于對照菌株AC10012在供氧充足條件下所表現(xiàn)出的解鉀活性?？梢姡伤锿寥婪蛛x得到的硅酸鹽細菌菌株在水田等溶氧濃度相對較低的環(huán)境下，仍具有較高的溶解環(huán)境中不溶性鉀元素的能力，使鉀元素更易被作物吸收利用，因而具有被開發(fā)作為生物鉀肥有效成分施用于水田作物的較大潛力。而分離自玉米田土壤的h-5在供氧條件較好的環(huán)境中，其解鉀活性則相對高于目前市場上常用于生產(chǎn)生物鉀肥的生產(chǎn)菌株，因而具有被開發(fā)用作旱田作物生物肥料有效成分的潛力。

2.7 在不同溶氧發(fā)酵條件下菌株的解硅活性

以吸光度為縱坐標，硅標準溶液濃度為橫坐標，進行標準曲線的繪制，得到其回歸方程為■= 0.859 9x+0.006 8，r=0.999 8。

在不同溶氧發(fā)酵條件下進行發(fā)酵，測定對照菌株AC10012及其他各供試菌株的解硅活性，每項3個平行，取平均值。根據(jù)樣品液吸光度的平均值，代入回歸方程即可得出樣品液中的硅含量，結(jié)果見圖5。根據(jù)結(jié)果，分離得到的硅酸鹽細菌菌株的解硅活性均明顯高于對照菌株AC10012，其中活性最高的菌株h-5在搖瓶發(fā)酵條件下，其解硅活性比對照菌株高出很多，而且也明顯高于其他分離得到的供試菌株的解硅活性，具有作為生物肥料的有效成分同時為作物提供易于吸收利用的鉀和硅等營養(yǎng)元素增加作物產(chǎn)量的潛力。另外，供氧條件不同，不同供試菌株也表現(xiàn)出不同程度的解硅能力，其中對照菌株AC10012所受影響最大，第三組試驗中，其解硅活性還不足第一組試驗時的1/6，分離自玉米田土壤的菌株h-5的解硅能力也受到了較大影響，下降50%以上；在供氧充足的條件下，菌株h-5的解硅能力雖高于菌株s-2和s-4，但在溶氧濃度降低的條件下，菌株s-2和s-4的解硅活性則幾乎未受影響（僅下降了5%左右），高于相同條件下菌株h-5的解硅能力?？梢?，對于溶氧濃度較低的水田環(huán)境來說，由水田土壤分離得到的硅酸鹽細菌菌株s-2和s-4仍能保持較高的解硅活性，為作物提供易于吸收利用的硅等營養(yǎng)元素，具有作為生物肥有效成分應(yīng)用從而增加作物產(chǎn)量的潛力。

3 討論

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，種植農(nóng)作物時常常需大量施用化肥補充土壤中的鉀等營養(yǎng)元素來提高農(nóng)作物的產(chǎn)量[14]。大量施用化肥造成了諸如土壤結(jié)構(gòu)破壞、有機質(zhì)含量下降、農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量下降、地下水污染嚴重、江河湖泊的富營養(yǎng)化等一系列嚴重的生態(tài)環(huán)境問題[15]。而土壤本身作為一個天然鉀庫，其每公頃土壤耕作層中含鉀量約為26 100 kg，但是90%～98%以上的鉀存在于正長石和云母等礦物中，很穩(wěn)定，不能直接被植物吸收利用，這就形成了土壤既富含鉀又缺鉀的現(xiàn)象[16，17]。在化學鉀肥污染嚴重的今天，開辟新的效果好、成本低、又不污染環(huán)境的硅酸鹽細菌來挖掘土壤中的鉀素資源，對發(fā)展生態(tài)、經(jīng)濟農(nóng)業(yè)具有十分重要的意義。

硅酸鹽細菌又稱為鉀細菌，是指能分解硅酸鹽類礦物的細菌。硅酸鹽細菌菌劑作為一種微生物肥料，其功能的有效發(fā)揮必須滿足兩個基本條件：一是菌株的高效性，二是菌株本身對土壤環(huán)境的適應(yīng)性[18，19]。研究以農(nóng)田土壤為樣品，從中分離具有分解硅酸鹽類礦物能力的硅酸鹽細菌菌株，對農(nóng)田土壤環(huán)境的適應(yīng)潛力通常較強，作為生物肥料的有效成分用于農(nóng)作物栽培的可行性較大。并且經(jīng)測定，分離得到的硅酸鹽細菌菌株h-5在供氧充足的條件下具有較強的解硅、解鉀能力，作為高效菌株用于生產(chǎn)生物肥料的潛力較大。另外，目前所報道的用于生物肥料的硅酸鹽細菌通常是單一利用其解鉀或解硅等能力，為作物提供相應(yīng)肥料，而利用一株硅酸鹽細菌的解鉀和解硅等多種能力為作物提供復合肥料的報道則較少，而分離篩選得到的菌株h-5在供氧充足條件下的解硅、解鉀能力均較強，應(yīng)具有作為生物肥料出發(fā)菌株同時為作物提供鉀和硅等復合肥料的能力，具有進一步研究的價值。

另外，水田和旱田的自然環(huán)境是有一定差異的，其中最主要的差異是水田和旱田的溶氧條件不同，一般情況下，水田環(huán)境的氧含量明顯低于旱田。然而目前關(guān)于硅酸鹽細菌研究的報道中，還未見有關(guān)硅酸鹽細菌作為生物肥料的有效成分應(yīng)用時對水田和旱田不同環(huán)境中氧含量需求情況的報道。本試驗選取了水田和旱田土壤并以不同的供氧條件分別分離硅酸鹽細菌，并且對篩選所得到的硅酸鹽細菌菌株在不同溶氧環(huán)境下的解硅、解鉀能力進行了初步研究，分別得到了在充足供氧和微氧環(huán)境下解硅、解鉀活性較高的菌株h-5和s-2、s-4，其中菌株h-5具有作為生物肥料有效成分用于旱田作物從而增加作物產(chǎn)量的潛力，而菌株s-2、s-4則有可能作為生物肥料有效成分用于水田作物，為作物提供易于吸收利用的鉀、硅等營養(yǎng)元素，以增加作物產(chǎn)量。而菌株h-5和s-2、s-4進入實際生產(chǎn)應(yīng)用所需的條件及實際應(yīng)用的可行性則有待進一步研究。

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