玉米抗蟲新種質的創(chuàng)制

摘要：收集轉外源抗蟲基因Cry1C*的HiII玉米材料T1代陽性轉化單株花粉，與生產(chǎn)上常用的鄭58、248、Ye478、昌7-2等30多份自交系測交和回交，并經(jīng)200 mg/L的草胺膦噴施、PCR檢測、大田鑒定等方法對后代植株進行陽性單株篩選，連續(xù)進行5次回交和篩選，最終自交純合獲得含Cry1C*基因抗蟲玉米新系32份。

關鍵詞：玉米；轉抗蟲基因；新種質創(chuàng)制

中圖分類號：S513；S336 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5137-03

Breeding of New Maize Germplasm with Borer Resistance

ZHANG Shi-long1，HE Zheng-hua1，Qiu Fa-zhan2，HUANG Yi-qin1

（1.Food Crops Institute， Hubei Academy of Agriculture Science，Wuhan 430064，China；

2. College of Plant Science Technology， Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： Breeding new borer-resistant varieties was an effective method to prevent pests of maize. The pollens from T1 positive plants of HiII transformed with borer-resistant gene Cry1C* through particle gun bombardment were collected to pollinate more than 30 important inbreds such as Zheng58， 248， Ye478， Chang7-2 and so on， and then backcrossed with these inbreds as recurrent parents. Subsequently， the positive plants were obtained by 200 mg/L phosphinothricin screening， PCR validation and field identification. After continuous backcrossing and screening for 5 times， 32 new borer-resistant lines with Cry1C* gene were bred by final selfing.

Key words： maize； transforming insect-resistant gene； creation of new germplasm

玉米螟是我國玉米主要害蟲之一， 在我國的華北、東北、華東及西北危害嚴重。玉米螟可危害玉米植株地上的各個部位，使受害部分喪失功能。通常春玉米的受害株率為30%左右，減產(chǎn)10%。夏玉米受害較重，一般減產(chǎn)20%～30%，嚴重發(fā)生時，被害株率達到90%，減產(chǎn)30%左右[1]。由于近年玉米種植面積擴大、 新品種生育期延長、種植密度增加以及氣候等原因，玉米螟危害呈現(xiàn)逐年嚴重趨勢，經(jīng)濟損失較大[2]。

生產(chǎn)實踐表明，創(chuàng)制抗蟲玉米新種質進而選育抗蟲新品種是解決玉米螟危害的有效途徑。然而，傳統(tǒng)育種手段存在周期長、抗源匱乏、雜交不育等難以克服的弊端。近年來，隨著基因工程技術的快速發(fā)展，利用轉基因技術培育抗螟品種（系）已成為控制玉米螟危害的一種重要手段[3，4]。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術應用服務組織（ISAAA）統(tǒng)計，2011年全球轉基因抗蟲玉米的種植面積達到4 330萬hm2，占全球玉米種植面積的27.2%[5]。

本研究擬將與抗除草劑Bar基因緊密連鎖的外源抗蟲基因Cry1C*轉入鄭58、248、Ye478、昌7-2等生產(chǎn)上應用廣泛的多份自交系中，創(chuàng)制一批抗蟲自交系，為選育抗蟲玉米新品種提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所采用玉米材料為鄭58、248、Ye478、昌7-2、豫82、4866、5AD、B73、M54、V190、V191、R060、 HZ111、HZ127、VA0301、VA0302、VA0303、A3566、DN6、DN9、CML50、GEMS16、CML103、W043、F06、8317、BN486、Z069、520、CML17、F11055、F11057、F11059、F11061、F11063、F11065等，均為生產(chǎn)上應用廣泛的自交系。轉外源抗蟲基因Cry1C*的HiII 玉米材料T1代陽性轉化單株花粉由華中農(nóng)業(yè)大學玉米研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取與濃度檢測 玉米基因組DNA提取采用改良的CTAB法[6]，使用UV-2102 PC型紫外可見分光光度計測定DNA濃度和純度，并將其稀釋為20 ng/μL備用。

1.2.2 目的基因PCR擴增引物序列及反應程序 引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列及PCR反應程序見表1。

1.2.3 典型自交系的轉化 收集轉外源抗蟲基因Cry1C*的HiII玉米材料T1代陽性轉化單株花粉，與生產(chǎn)上常用的鄭58、248、Ye478、昌7-2等30多份玉米自交系測交。

1.2.4 200 mg/L草胺膦初步篩選及PCR鑒定 將測交所獲得的種子播種在苗圃中，待苗長到3～4片葉時，用200 mg/L草胺膦噴霧[7]，保留耐受除草劑的植株，移栽至大田。提取存活植株幼嫩葉片DNA，用特定引物進行PCR檢測，確定含有抗蟲基因Cry1C*的陽性植株。

1.2.5 抗蟲鑒定 采用田間自然感蟲的方法[8]。在自然狀態(tài)下，將陽性抗蟲植株（GM）作好標記，與對應的輪回親本植株隨機混種，除了不噴施防治螟蟲的農(nóng)藥外，其他管理措施同大田玉米。在玉米整個生長周期中觀察、比較抗蟲植株與輪回親本植株的抗蟲表現(xiàn)。挑選出無任一地上器官遭受螟蟲危害的陽性單株進入下一輪的回交。

1.2.6 典型抗蟲系的獲得 以通過200 mg/L草胺膦初選、PCR檢測、田間鑒定而獲得的陽性單株為母本，再次與對應的輪回親本回交，收獲種子后，將種子播種在苗圃中，待玉米苗長到3～4片葉時，進入“200 mg/L草胺膦初選—PCR檢測—田間鑒定”程序，所得到的陽性單株進行下一輪的回交和鑒定過程。在BC5代，將得到的陽性單株自交純合，最終獲得穩(wěn)定的抗蟲新系。

2 結果與分析

2.1 測交、回交后代的除草劑初選結果

測交后代種子播種在苗圃中，待植株長到3～4片葉時，噴灑200 mg/L的草胺膦，7 d后，一部分玉米苗葉片、莖稈萎蔫乃至整株呈現(xiàn)水漬狀，最終枯死；而另一部分則正常生長，對草胺膦具有明顯的抗性（圖1）。由于外源抗蟲基因Cry1C*導入時搭載有與之緊密連鎖的抗除草劑Bar基因，因此，耐草胺膦的單株意味著可能含有抗蟲基因，是陽性單株。

2.2 轉化體的PCR鑒定結果

抽提玉米耐草胺膦單株葉片DNA，用特定引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，絕大部分泳道均在近500 bp的位置有一條亮帶，少數(shù)泳道無帶（圖2）。存在特異條帶泳道所對應的單株是陽性單株，含有Cry1C*基因。無特異條帶泳道所對應的單株不含有Cry1C*基因而具有耐草胺膦的特性，可能是噴灑草胺膦不均勻所致，抑或該單株本身對除草劑具有較強的耐受性。

2.3 田間抗蟲鑒定結果

試驗結果表明，在自然感蟲狀態(tài)下，從苗圃中移栽到大田的絕大多數(shù)輪回親本植株被螟蟲危害，而經(jīng)除草劑初選、PCR檢測確定為陽性的單株絕大部分具有顯著的抗蟲效果（圖3）。少數(shù)陽性單株也遭到危害，可能的原因是目的基因表達量過低而起不到殺蟲效果，抑或目的基因處于“沉默”狀態(tài)。

2.4 抗蟲玉米新材料的獲得

經(jīng)過連續(xù)5代回交、200 mg/L草胺膦初選、PCR檢測及大田鑒定，最后自交純合后獲得含Cry1C*基因抗蟲玉米新系32份。所獲得的新系除在抗蟲性狀上與輪回親本有顯著差異外，在其他個別農(nóng)藝性狀也存在極微小的差別。

3 結論與討論

植物細胞是一個平衡體系， 進入一個外源基因必然會擾亂其固有的平衡，在達到一個新的平衡前，細胞會動用各種酶系統(tǒng)以及其他排異措施將外源基因大量產(chǎn)生的非必需產(chǎn)物進行清除或初步降解再利用，這極有可能使外源基因處于極低表達量或“沉默”狀態(tài)[9]。本研究中，對經(jīng)除草劑草胺膦篩選、PCR檢測所獲得的陽性植株仍進行田間鑒定，即是基于對已整合進玉米基因組的外源基因是否表達、如何表達以及表達量多少的考慮。只有在田間生長過程中表現(xiàn)出應有的抗性才是真正的陽性植株，也才有實踐意義。

玉米抗螟蟲性能的鑒定一般有室內(nèi)喂蟲鑒定和田間接卵鑒定兩種方法[10-12]。由于外源抗蟲基因在玉米植株內(nèi)表達具有時空性，且玉米螟的危害具有周期長、地上部所有器官均可危害等特點，使得上述鑒定方法出現(xiàn)明顯的不足。田間自然感蟲的鑒定方法雖然受環(huán)境因素影響，但它可以鑒定玉米任一地上器官在玉米整個生長周期內(nèi)對螟蟲所有世代的抗蟲效果。由于要經(jīng)過連續(xù)5代的鑒定，并且嚴格遵循“任一器官有侵害癥狀該植株就淘汰”的篩選標準，從總體上看，能最大限度地保證選留的陽性植株具有好的抗蟲效果，所選出的抗蟲玉米新系能用于生產(chǎn)實踐。

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