一氧化氮供體SNP對(duì)水稻根中由硒引起的脂質(zhì)過(guò)氧化的調(diào)節(jié)作用

摘要：研究以0.2和20 μmol/L Na2SeO3及一氧化氮供體硝普鈉（SNP）處理對(duì)水稻根中根系活力和硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物含量，愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）以及抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性等生理生化指標(biāo)的影響。結(jié)果表明，1 μmol/L SNP處理顯著提高0.2 μmol/L Na2SeO3處理下水稻根系活力，SNP通過(guò)促進(jìn)CAT酶活性，緩解了膜脂過(guò)氧化；在20 μmol/L Na2SeO3處理下，1 μmol/L SNP明顯促進(jìn)SOD酶活性，但顯著降低APX酶活性，顯著降低根系活力。NO對(duì)水稻根中Se引起的抗氧化活性變化具有調(diào)節(jié)作用，根系活力可以作為評(píng)價(jià)抗氧化活性的重要參考。

關(guān)鍵詞：水稻；硒；一氧化氮；抗氧化作用

中圖分類(lèi)號(hào)：Q945 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）21-5133-04

Effects of Exogenous Nitric Oxide Donor SNP on Lipid Peroxidation Caused by Selenium in Roots of Rice Seedlings

XIAO Qiang

（Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province / Hubei Institutes for Nationalities， Enshi 445000， Hubei， China）

Abstract： In this study， we reported some antagonist effects of exogenous nitric oxide on oxidative stress of rice induced by selenium. The root activity， the contents of TBARS and the activities of GPX， SOD， CAT and APX in roots of rice seedlings treated with varied concentrations of selenium and 1 μmol/L SNP were investigated. The results showed that the root activity increased by treatment of SNP in 0.2 μmol/L Na2SeO3 group. SNP alleviated significantly the lipid peroxidation in rice seedlings via increasing CAT activities in rice root. In 20 μmol/L Na2SeO3 treated rice seedlings， SNP aggravated significantly the root activity loss via promoting SOD activities and repressing APX activity. Taken together， results suggested that NO regulates antioxidative activity caused by selenium in roots of rice seedlings. Root activity can be used as reference index of evaluating antioxidative activity.

Key words： rice； selenium； nitric oxide； antioxidation

一氧化氮（Nitric oxide，NO）是植物中一種重要的信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育，促進(jìn)植物細(xì)胞衰亡等方面發(fā)揮著重要作用[1]，進(jìn)一步研究表明NO在植物中的某些功能與它對(duì)活性氧（Reactive oxygen species，ROS）代謝水平的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，如NO可作用于煙草中含血紅素鐵的過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）和含非血紅素鐵的抗壞血酸過(guò)氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX），參與對(duì)活性氧代謝的調(diào)節(jié)[2]。NO還可能通過(guò)提高超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性和降低膜脂過(guò)氧化作用來(lái)減緩缺水造成的離體水稻葉片的衰老[3]。NO也可以通過(guò)促進(jìn)鎘在根部積累并上調(diào)鐵吸收相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)擬南芥對(duì)鎘毒的抗性[4]。我們的研究結(jié)果也表明0.01 mmol/L硝普鈉（Sodium nitroprusside，SNP）可顯著緩解鑭引起的氧化脅迫[5]。

硒（Se）是環(huán)境中一個(gè)十分重要的生命元素，它與硫元素在化學(xué)特性上有很多相似之處，硒在動(dòng)物和人體內(nèi)最主要的生物學(xué)功能是作為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶系（GSH-Px）的組成成分，參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，清除自由基，減少對(duì)生物膜等造成的機(jī)體過(guò)氧化損傷。在植物中，Se可以顯著增強(qiáng)小麥、玉米、大豆和油菜體內(nèi)抗氧化能力，維持植株正常生長(zhǎng)[6]。土壤環(huán)境因子、養(yǎng)分供應(yīng)狀況等對(duì)植物Se吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、富集以及代謝的影響已有較多報(bào)道。迄今，對(duì)于信號(hào)分子尤其是NO是否參與了Se誘導(dǎo)的抗氧化活性調(diào)節(jié)過(guò)程仍不為人知，我們?cè)诖藞?bào)道外源SNP對(duì)由亞硒酸鈉（Na2SeO3）誘導(dǎo)的水稻根中抗氧化活性變化的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

水稻品種為金優(yōu)58，種子經(jīng)0.1% HgCl2消毒，水洗，25℃浸種、催芽。1周后用木村B溶液水培，溫度26 ℃，光照400 μmol/（m2·s），光/暗時(shí)間為12 h/12 h，至兩葉一心期在培養(yǎng)液中加入Se和SNP同時(shí)進(jìn)行處理。Na2SeO3和SNP均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司（BBI原裝）。設(shè)3個(gè)Se處理，分別為0、0.2和20 μmol/L Na2SeO3；每種Se處理再設(shè)兩種SNP濃度，分別為0和1 μmol/L，共6個(gè)處理組。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每天更換處理液1次，在處理3 d后測(cè)定表明各處理間根系活力差異顯著，因此取相應(yīng)時(shí)段幼根進(jìn)行相關(guān)生理生化指標(biāo)測(cè)定。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 根系活力 采用TTC法進(jìn)行測(cè)定[7]。

1.2.2 硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物（TBAPS）含量測(cè)定 取幼根0.7 g，加入4 mL 10% 三氯乙酸（TCA）研至勻漿，離心，取上清液，參照Dhindsa等[8]的方法測(cè)定。

1.2.3 酶液制備 取0.5 g新鮮水稻幼根于冰浴研缽中，加少許石英砂和1 mL預(yù)冷的酶提取液（用50 mmol/L、pH 7.8的磷酸緩沖液配制，內(nèi)含1%聚乙烯吡咯烷酮，5 mmol/L的乙二胺四乙酸），測(cè)定APX時(shí)，提取液含5 mmol/L ASA，迅速勻漿，4 ℃，20 000 g離心20 min，取上清液備用。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用Bradford法[9]測(cè)定，以牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 SOD活性測(cè)定 參照Beauchamp等[10]所建立的方法測(cè)定，SOD活性分析前過(guò)Sephadex G-25柱以避免SNP對(duì)活性測(cè)定的干擾，以抑制氮藍(lán)四唑（NBT）在光照下被還原50%的酶量為一個(gè)酶活性單位（U）。

1.2.6 GPX活性測(cè)定 參照Ruan等[11]的方法測(cè)定，以460 nm吸光值每分鐘上升0.1為一個(gè)酶活性單位（U）。

1.2.7 CAT活性測(cè)定 參照Chance等[12]的方法測(cè)定，以240 nm吸光值每分鐘減小0.1為一個(gè)酶活性單位（U）。

1.2.8 APX活性測(cè)定 參照Parida等[13]的方法測(cè)定，以280 nm吸光值每分鐘減小0.1為一個(gè)酶活性單位（U）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，以O(shè)rigin軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系活力的改變

由圖1可知，與對(duì)照組相比，0.2和20 μmol/L Na2SeO3處理對(duì)水稻根系活力沒(méi)有顯著影響；20 μmol/L Na2SeO3處理組顯著高于0.2 μmol/L Na2SeO3處理組；在無(wú)Se情況下，1 μmol/L SNP可以顯著提高水稻根系活力（P<0.05）。外加1 μmol/L SNP顯著提高0.2 μmol/L Na2SeO3處理下水稻根系活力；但在20 μmol/L Na2SeO3處理的水稻幼根中，外加1 μmol/L SNP則顯著降低根系活力。

2.2 TBARS含量的改變

如圖2所示，和根系活力相似，0.2和20 μmol/L Na2SeO3處理對(duì)水稻幼根TBARS含量沒(méi)有顯著影響；兩種濃度Na2SeO3處理之間差異不顯著。在無(wú)Se情況下，1 μmol/L SNP對(duì)TBARS含量亦無(wú)顯著影響。外加1 μmol/L SNP對(duì)0.2和20 μmol/L Na2SeO3處理組亦無(wú)顯著影響。

2.3 抗氧化酶活性的改變

作為植物抗氧化系統(tǒng)的一個(gè)重要組分，抗氧化酶在消除ROS方面具重要作用。SOD，GPX，CAT及APX的活性在各種脅迫下經(jīng)常發(fā)生改變。與對(duì)照相比，0.2 μmol/L Na2SeO3處理對(duì)幼根中SOD的活性無(wú)顯著影響；20 μmol/L Na2SeO3處理則顯著下降（P<0.05）；單獨(dú)1 μmol/L SNP處理對(duì)幼根中SOD活性亦無(wú)顯著影響。外加1 μmol/L SNP可以顯著緩解20 μmol/L Na2SeO3處理引起的SOD活性下降（圖3A）。與SOD活性相比，不同處理?xiàng)l件下，GPX活性表現(xiàn)出不同的特征。各處理組間GPX活性差異不顯著（圖3B）。CAT活性變化如圖3C所示，與水稻幼根中SOD活性變化類(lèi)似，0.2 μmol/L Na2SeO3處理對(duì)幼根中CAT的活性無(wú)顯著影響；20 μmol /L Na2SeO3處理則顯著下降（P<0.05）；單獨(dú)1 μmol/L SNP處理顯著提高幼根中CAT活性。外加1 μmol/L SNP顯著促進(jìn)0.2 μmol/L Na2SeO3處理組活性（P<0.05），但對(duì)20 μmol/L Na2SeO3處理組CAT活性無(wú)顯著影響。如圖3D所示，與對(duì)照相比，0.2 μmol/L Na2SeO3處理顯著促進(jìn)幼根中APX活性（P<0.05），20 μmol/L Na2SeO3處理引起幼根中APX活性顯著下降（P<0.05）；單獨(dú)SNP處理對(duì)幼根APX活性無(wú)顯著影響。外加1 μmol/L SNP對(duì)0.2 μmol/L Na2SeO3處理組幼根中APX活性亦無(wú)影響，但卻顯著降低20 μmol/L Na2SeO3處理組幼根中APX（P<0.05）。

3 討論

SNP普遍作為NO的外源供體，Delledonne等[14]發(fā)現(xiàn)0.5 mmol/L SNP大約釋放2.0 μmol/L NO。預(yù)備實(shí)驗(yàn)以0、0.2、0.5、1、2、5、10、50 μmol/L SNP處理水稻根系，結(jié)果表明濃度達(dá)到1 μmol/L時(shí)，根系長(zhǎng)度顯著高于對(duì)照組，而濃度超過(guò)5 μmol/L 時(shí)，根系生長(zhǎng)與對(duì)照不存在差異，據(jù)此確定了本試驗(yàn)SNP濃度；同時(shí)研究了0、0.2、2、10以及20 μmol/L Na2SeO3對(duì)葉綠素含量的影響，結(jié)果顯示在2 μmol/L以下差異不顯著，而10 μmol/L和20 μmol/L均顯著降低葉綠素含量，據(jù)此確定了本試驗(yàn)硒濃度。

從本研究中可以看出，SNP和Se對(duì)根系活力存在協(xié)同效應(yīng)：SNP協(xié)同低濃度Se可以提高根系活力，而SNP與高濃度Se共同處理則顯著降低根系活力。這與我們關(guān)于SNP和Se對(duì)水稻幼苗葉綠素含量的影響具有相似規(guī)律（見(jiàn)另文）。其可能原因在于：在厭氧情況下，植物根系線粒體是NO合成的重要場(chǎng)所[15]，NO通過(guò)降低低濃度Se引起的線粒體電子傳遞速率上升[16]而發(fā)揮抗氧化功能，維持了根系還原能力；另一方面，NO也加劇了高濃度硒引起的線粒體電子傳遞速率下降，進(jìn)一步抑制了根系呼吸。

已有報(bào)道，低濃度硒可以顯著提高植物中抗氧化酶SOD和GPX轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而激活了植物抗氧化保護(hù)機(jī)制[17，18]。本研究與此不同，0.2 μmol/L Na2SeO3處理對(duì)SOD活性沒(méi)有影響，而20 μmol/L Na2SeO3處理則引起SOD活性顯著下降；GPX活性則不受Se處理濃度影響。這種差異可能源于所采用的不同植物材料和不同器官（根和葉片）。0.2 μmol/L Na2SeO3處理顯著提高了水稻根中APX酶活性，1 μmol/L SNP處理也可以提高水稻根中CAT酶活性，兩者都可以有效清除ROS，維持根系活力。Beligni等[19]認(rèn)為，作為一種抗氧化劑，NO可以抵消許多由ROS介導(dǎo)的細(xì)胞毒害作用。在本研究中，總體來(lái)看，0.2 μmol/L Na2SeO3處理下，外加1 μmol/L SNP對(duì)于水稻幼根中CAT酶活性有顯著提高效應(yīng)，與此同時(shí)，根系活力顯著升高；表明根系脫氫酶活性顯著升高。20 μmol/L Na2SeO3處理下，根中SOD活性顯著下降，與此同時(shí)CAT和APX活性也是下降的，有利于維持對(duì)ROS清除的相對(duì)平衡，因此，根系活力與對(duì)照相比差異不顯著。但在外加1 μmol/L SNP情況下，SOD活性上升到對(duì)照組水平，而APX酶活性水平進(jìn)一步下降，由此導(dǎo)致ROS產(chǎn)生與清除不平衡，ROS累積加劇了對(duì)根系的損傷，引起根系活力顯著下降。上述研究結(jié)果與NO緩解高濃度稀土元素鑭引起的氧化性損傷以及鎘毒性的研究結(jié)果存在較大差異[5，20]。其可能原因在于鑭和鎘是植物非必需金屬元素，其毒性與金屬離子引起的過(guò)氧化有關(guān)[20]，NO可以直接拮抗其導(dǎo)致的過(guò)氧化效應(yīng)；而Se屬于非金屬元素，主要通過(guò)類(lèi)似植物必需元素硫方式參與細(xì)胞生化反應(yīng)[21]；NO對(duì)其生理生化效應(yīng)調(diào)節(jié)的詳細(xì)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

已有研究證實(shí)高等植物根部線粒體電子傳遞鏈?zhǔn)荖O合成的主要場(chǎng)所[15]。在本研究中，1 μmol/L SNP促進(jìn)了0.2 μmol/L Na2SeO3處理下水稻幼根中CAT酶活性，提高了根系活力；外加1 μmol/L SNP促進(jìn)20 μmol/L Na2SeO3處理組水稻幼根SOD活性顯著上升，而APX酶活性水平進(jìn)一步下降，由此導(dǎo)致ROS產(chǎn)生與清除失衡，引起根系活力顯著下降。上述主要研究結(jié)果表明NO對(duì)于水稻根中Se引起的脂質(zhì)過(guò)氧化存在明顯調(diào)節(jié)作用，由于高等植物根部線粒體可以利用亞硝酸鹽合成NO[15]，通過(guò)合理施用氮肥以調(diào)節(jié)水稻根部?jī)?nèi)源NO合成，對(duì)于有效改善高硒地區(qū)水稻生長(zhǎng)具有重要實(shí)踐意義。

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