大蒜拮抗性內(nèi)生細(xì)菌的篩選

摘 要：本實驗以市面銷售大蒜作為實驗材料，通過表面消毒，利用粉碎機粉碎方法得到植物組織原液的方法，由平板涂布法分離得到藥用植物組織內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌或者直接在無菌環(huán)境中取大蒜組織塊在PDA培養(yǎng)基或NA培養(yǎng)基直接進行培養(yǎng)，通過不斷地分離純化提取得到的較純植物內(nèi)生細(xì)菌作為目標(biāo)菌，以大腸桿菌（Escherichia coli），耐甲氧西林金色葡萄球菌（methicillin resistant Staphylococcus aurous，MRSA），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtitles）作為指示菌進行內(nèi)生菌抑菌試驗，由內(nèi)生細(xì)菌對不同病原菌的抑菌圈大小的比較篩選出抑菌最強的內(nèi)生細(xì)菌。研究結(jié)果表明：大蒜中有大量的內(nèi)生細(xì)菌，分離得到16株內(nèi)生細(xì)菌，16株菌對4種以上病原菌均有不同程度的抑制作用。其中DS1、DS2和BS2對四種病原菌的拮抗能力均較強，BS2對四種靶標(biāo)菌的相對抑菌率在200%以上。

關(guān)鍵詞：大蒜 內(nèi)生細(xì)菌 拮抗作用 篩選

中圖分類號：S633.4 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2013）05（b）-0217-02

大蒜（Alliums ativum L.）屬于百合科（Liliaceace）蔥屬類的植物，據(jù)研究大蒜的鱗莖含有豐富的生物活性成分以及營養(yǎng)物質(zhì)，同時也具有良好的抗癌防癌作用，不但對癌細(xì)胞有直接殺傷作用，而且能抑制致癌物質(zhì)（如亞硝胺）在人體內(nèi)的合成，并能防治腦血管病、糖尿病等常見病狀[1]，經(jīng)常使用大蒜也能增加能量轉(zhuǎn)換和促進血液循環(huán)，提高我們肌體免疫力，恢復(fù)和重建愛滋病患者的免疫系統(tǒng)功能等[2]。此外，大蒜里的某些成份，有類似維生素E與維生素C的抗氧化、防衰老特性，自古被稱為天然殺菌劑，有“天然抗生素”之稱[3]。大蒜除了有以上作用外，其生物體內(nèi)所含的硫化合物也具有較強的抗菌消炎作用，對多種細(xì)菌、真菌都有殺死和抑制的作用[4]。當(dāng)前，關(guān)于藥用植物大蒜內(nèi)生細(xì)菌的研究報道少見。面對著各種各樣新的疾病對人們健康的威脅，抗生素的廣泛運用使致病菌的賴藥性變得越來越強，迫使人們不得不尋找新的治病材料和途徑。與此同時人們的生活水平的提高，對健康越來越注重，提倡綠色無公害食品，需要采用一種新的方法取代化學(xué)防腐劑。因此，當(dāng)前人們正致力于從動植物及微生物的代謝產(chǎn)物中尋找抗菌物質(zhì)以取代化學(xué)防腐劑，利用藥用植物內(nèi)生細(xì)菌進行工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)某些重要天然藥物。植物內(nèi)生細(xì)菌一直以來備受關(guān)注，因為其具有的作為新型藥物篩選資源的巨大潛力[5]。不僅如此，植物內(nèi)生細(xì)菌的發(fā)展也能有效地緩解一些天然藥用植物的資源缺失，甚至對生態(tài)平衡破壞，物種滅絕也將起到有效緩解作用，同時也為植物資源的合理有效利用提供了理論基礎(chǔ)[6]。本實驗對藥用植物大蒜內(nèi)生細(xì)菌進行分離純化以及拮抗菌篩選試驗，進一步明確藥用植物大蒜內(nèi)生細(xì)菌及其抗菌作用，為大蒜內(nèi)生菌的進一步發(fā)展及開發(fā)利用以及探尋有效拮抗微生物資源提供基礎(chǔ)保障。

1 材料與方法

1.1 實驗植物

市售紫皮獨蒜（Alliums ativum L.（Garlic））、白皮鮮蒜（Alliums ativum L.（Garlic））。

1.2 靶標(biāo)菌

大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtitles）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin resistant Staphylococcus aurous，MRSA），均由由本校病理實驗室提供。

1.3 培養(yǎng)基

大蒜組織的表面消毒及組織液制備：稱取10 g供試大蒜組織樣品，放于滅菌的培養(yǎng)皿或者三角瓶中，無菌水洗3至5遍，再用百分之五的次氯酸鈉消毒3次，2 min每次，后用無菌水再洗3至5遍，用打漿機打碎，最后將粉碎的供試植物組織液置于無菌三角瓶中196480cbb39e53a959546c17453d654d備用[9]。

大蒜內(nèi)生細(xì)菌的分離純化：在無菌操作臺上分別用無菌移液槍將得到的大蒜組織液取100 ul種到無菌PDA平板培養(yǎng)基上，取最后一次洗滌液作為對照，每種處理重復(fù)三次。37 ℃培養(yǎng)18～24 h。待培養(yǎng)基上長出菌落時，根據(jù)菌落的顏色和形態(tài)，將不同種類的內(nèi)生細(xì)菌劃線接種至PDA無菌平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到無純培養(yǎng)后接種到斜面保存?zhèn)溆肹10～11]。

1.5 大蒜內(nèi)生細(xì)菌的拮抗性篩選

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜內(nèi)生細(xì)菌的分離

2.2 拮抗菌株的篩選結(jié)果分析

3 結(jié)論與討論

（1）通過對大蒜內(nèi)生細(xì)菌的分離純化及其對一些常見病原菌的拮抗性作用，表明在大蒜內(nèi)生細(xì)菌中廣泛存在具有較高抗菌活性的菌株。拮抗實驗表明大蒜鱗莖內(nèi)生菌主要為細(xì)菌，故內(nèi)生細(xì)菌為其優(yōu)勢內(nèi)生菌，所分離的16株內(nèi)生細(xì)菌對病原菌均有廣譜抗菌作用。

（2）本實驗表明大蒜內(nèi)生細(xì)菌在常溫下對常見的病原菌有拮抗作用，但其經(jīng)過熱處理后其抗菌活性是否穩(wěn)定還有待進一步研究。

（3）從藥用植物大蒜中篩選出的內(nèi)生細(xì)菌DS1，DS2和BS2對病原菌的拮抗性明顯，因此，具有廣闊的開發(fā)前景，具有潛在的應(yīng)用價值。

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