血管周圍脂肪組織中AngⅡ介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制

史吉瑩，劉唐威，楊國勛，黃江南，宋夢(mèng)瑩，錢靜

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院高血壓病區(qū)，南寧 530021）

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）的增殖在血管重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展中起主要作用［1，2］。多種生物活性物質(zhì)通過不同的信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與了VSMC的增殖過程，其中氧化應(yīng)激觸發(fā)的氧化還原信號(hào)途徑已經(jīng)成為防治血管增殖性疾病的研究方向［3，4］。我們之前的研究已證實(shí)血管周圍脂肪組織（perivascular adipose tissue，PVAT）是局部的RAS系統(tǒng)，可產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ），與高血壓血管重構(gòu)相關(guān)。同時(shí)，PVAT也是產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）的重要來源［5］，含有產(chǎn)生 ROS的 NAD（P）H 氧化酶系，而AngⅡ可以刺激NAD（P）H產(chǎn)生超氧化物。因此，本實(shí)驗(yàn)通過培養(yǎng)VSMC細(xì)胞、檢測(cè)VSMC增殖指標(biāo)表達(dá)來探討在PVAT中ROS介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖及遷移的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)

取大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，去除血管外膜和內(nèi)膜，將中膜剪成1個(gè)1 mm2大小組織塊，采用貼壁法自原代細(xì)胞開始培養(yǎng)，置入10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中。在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，實(shí)驗(yàn)選用4～10代培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞在光鏡下呈典型峰谷狀表現(xiàn)，α-actin檢查呈陽性染色。以傳代培養(yǎng)法調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.2 主要試劑和儀器

AngⅡ（Sigma，貨號(hào) A9525）、apocynin（Sigma，貨號(hào) A10809）、catalase（Sigma，貨號(hào) C1345）、PD98059（Sigma，貨號(hào)P215）、?；撬幔▏幖瘓F(tuán)化學(xué)世界有限公司，批號(hào) F20090223）、DTNB （Sigma，貨號(hào)43760）、α-actin抗體（武漢博士德生物工程有限公司）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）、細(xì)胞DNA含量檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）、過氧化氫檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）、流式細(xì)胞儀（美國貝克曼公司，型號(hào)LX-20）、熒光酶標(biāo)儀（型號(hào)FLX800，美國）。

1.3 活性氧檢測(cè)

將細(xì)胞種于6孔，板待貼壁后用無血清培養(yǎng)液按1∶1 000稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol/L，37℃孵育20 min。用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，收集細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液。使用熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光的強(qiáng)度。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

1.4.1MTT分析法：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽檢測(cè)AngⅡ誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖：按照時(shí)間分為：（1）正常對(duì)照組：不含任何藥物的培養(yǎng)液；（2）AngⅡ處理組：AngⅡ（終濃度 100 nmol/L）分別處理 12 h、24 h、48 h。按照濃度分為：（1）正常對(duì)照組：不含任何藥物的培養(yǎng)液；（2）AngⅡ處理組：AngⅡ （終濃度分別為 1 μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L）處理24 h。采用MTT分析血管平滑肌細(xì)胞增殖率。

1.4.2 NADPH氧化酶抑制劑、過氧化氫酶及ERK1/2抑制劑對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖、H2O2及HOCL的影響：實(shí)驗(yàn)分組為（1）對(duì)照組：未給予任何藥物處理；（2）AngⅡ處理組：AngⅡ（終濃度 100 nmol/L）處理 24 h；（3）apocynin+AngⅡ處理組：預(yù)先給予apocynin（終濃度 400 μmol/L）處理 20 min，然后 AngⅡ（終濃度 100 nmol/L）處理 24 h；（4）catalase+AngⅡ處理組：預(yù)先給予catalase（終濃度300 nmol/L）處理2 h，然后AngⅡ（終濃度100 nmol/L）處理24 h；（5）PD98059+AngⅡ處理組：同時(shí)給予 PD98059（終濃度 10 μmol/L）及 AngⅡ（終濃度 100 nmol/L）處理24 h。采用蛋白定量、流式細(xì)胞術(shù)分析血管平滑肌細(xì)胞總蛋白含量及細(xì)胞周期進(jìn)程。采用比色法檢測(cè)H2O2和HOCL水平。

1.5 MTT

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞，胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為1×105/mL，加入96孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后按上述步驟處理和備用細(xì)胞。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組6個(gè)復(fù)孔。常規(guī)操作，在酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)定光密度（optical density，OD）值。

1.6 細(xì)胞總蛋白含量分析

各孔加入100 μL組織細(xì)胞裂解液，吸取裂解液至0.5 mL干凈EP管中，12 000 r/min離心5 min，取上清；根據(jù)樣品數(shù)量，BCA試劑A加BCA試劑B（50∶1）配制適量BCA工作液，充分混勻；PBS完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取 10 μL稀釋至 100 μL，使終濃度為 0.5 mg/mL；將標(biāo)準(zhǔn)品按 0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，PBS補(bǔ)足到20 μL；加入5 μL蛋白樣品到96孔板的樣品孔中，PBS補(bǔ)足到20 μL；各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置30 min；測(cè)定A570波長(zhǎng)吸光值，根據(jù)吸光值和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣品蛋白濃度。

1.7 細(xì)胞周期檢測(cè)

將待測(cè)樣本制成單細(xì)胞懸液，4℃預(yù)冷PBS洗滌1次；2 000 r/min離心5 min，收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL；制備單細(xì)胞懸液用70%乙醇固定，4℃保存；取1 mL細(xì)胞懸液，加100 μL RNaseA 37℃孵育30 min；再加入300 μL PI混勻即可進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

1.8 細(xì)胞H2O2水平檢測(cè)

空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管各加入1 mL試劑一（37℃預(yù)溫），上述各管分別加入蒸餾水、H2O2標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液（163 mmol/L）、待測(cè)樣本均為 100 μL，混勻后37℃反應(yīng)1 min，各管分別加入1 mL試劑二，混勻，于405 nm處測(cè)各管吸光度值。按照南京建成生物工程研究所提供的計(jì)算公式計(jì)算出H2O2的濃度。

1.9 細(xì)胞HOCL水平檢測(cè)

細(xì)胞處理后，取培養(yǎng)上清70 μL，加入?；撬幔?0 mmol/L）25 μL，反應(yīng) 5 min 后，加入 1 mmol/L 5，5′-二硫-2-酸硝基苯甲酸 （5，5′-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）5 μL 反應(yīng) 5 min 后測(cè)定吸光度。在整個(gè)反應(yīng)體系中，HOCL氧化?；撬嵘膳；撬崧劝?，?；撬崧劝纷詈笱趸疍TNB生成5-硫-2-硝基苯甲酸 （5-thio-2-nitrobenzoic acid，TNB）。由于TNB在波長(zhǎng)412 nm處有一特異性最大吸收峰，因此測(cè)定在A412處吸光度可以反映HOCL的水平。

2.0 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有檢測(cè)指標(biāo)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，各計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性時(shí)，兩組間差異性比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用t′檢驗(yàn)；多組間比較采用Oneway ANOVA和Student-Newman-Keuls多重比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 平滑肌細(xì)胞的鑒定

鏡下見以平滑肌細(xì)胞為主的纖維樣細(xì)胞呈梭形、長(zhǎng)梭形或帶狀，核卵圓形居中。局部成束的細(xì)胞平行排列，部分區(qū)域細(xì)胞多層重疊，部分區(qū)域高低起伏呈“峰—谷”狀生長(zhǎng)。培養(yǎng)第5代細(xì)胞經(jīng)特異的平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，高倍鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)大量棕色、與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的纖維細(xì)絲，即平滑肌α-肌動(dòng)蛋白絲。核卵圓形居中，呈淡藍(lán)色。見圖1。

2.2 MTT試驗(yàn)結(jié)果

平滑肌細(xì)胞在AngⅡ以濃度1 μmol/L，即終濃度為100 nmol/L處理24 h后，與其他不同處理時(shí)間不同濃度比較（除外處理48 h的10 μmol/L濃度組）增殖明顯（P＜0.05），見表1。

表1 細(xì)胞經(jīng)不同濃度A n gⅡ處理后不同時(shí)間M T T的O D值（±s）T a b.1 O D v a l u e s o f M T T a f t e r t r e a t m e n t b y A n gⅡ a t d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s a n d t i m e p o i n t s（±s）O D v a l u e o f M T T 1 2 h 2 4 h 4 8 h 1 0 0 μ m o l/L g r o u p 0.2 5 4 0±0.0 1 9 8 0.4 3 4 2±0.0 2 0 6 0.4 5 5 6±0.0 3 1 2 1 0 μ m o l/L g r o u p 0.2 3 2 8±0.0 2 6 9 0.4 5 1 6±0.0 2 1 7 0.5 2 4 4±0.0 4 1 4 1 μ m o l/L g r o u p 0.2 3 9 2±0.0 3 4 4 0.5 2 3 4±0.0 0 7 4 1） 0.5 0 6 2±0.0 2 4 2 1 0 0 n m o l/L g r o u p 0.1 6 6 2±0.0 0 9 5 0.3 0 7 2±0.0 4 9 8 0.4 6 4 0±0.0 2 2 8 1 0 n m o l/L g r o u p 0.1 1 2 8±0.0 0 5 1 0.1 4 9 0±0.0 1 3 7 0.1 1 8 8±0.0 0 4 8 1）P ＜ 0.0 5 c o m p a r e d w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f t h e d i f f e r e n t p r o c e s s i n g t i m e s i n a d d i t i o n t o 1 0 μ m o l/L c o n c e n t r a t i o n a t 4 8 h.G r o u p

2.3 AngⅡ處理后對(duì)ROS影響

以AngⅡ終濃度100 nmol/L 24 h處理平滑肌細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞ROS水平（OD值），結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組（23.17±1.5）比較，AngⅡ處理組（55.33±1.4）ROS顯著增高（P＜0.05）。

2.3 NADPH氧化酶抑制劑、過氧化氫酶及ERK1/2抑制劑對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞總蛋白合成的影響

以AngⅡ終濃度100 nmol/L 24 h處理平滑肌細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞總蛋白，結(jié)果顯示AngⅡ處理后總蛋白水平由處理前的（0.413±0.006）mg/mL升高至（0.619±0.042）mg/mL，說明AngⅡ處理后能明顯增加平滑肌細(xì)胞DNA合成能力（P＜0.05），預(yù)先給予apocynin、catalase及PD98059與單用AngⅡ比較總蛋白合成分別下降至（0.471±0.008），（0.496±0.014），（0.448±0.013）mg/mL（P ＜ 0.05）。

2.4 NADPH氧化酶抑制劑、過氧化氫酶及ERK1/2抑制劑對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞周期的影響

以AngⅡ終濃度100 nmol/L 24 h處理平滑肌細(xì)胞后，采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期進(jìn)程情況。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，AngⅡ處理組細(xì)胞周期中 G1期降低，S期明顯增高（P＜ 0.05），說明 AngⅡ具有明顯誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞分裂、增殖的作用；預(yù)先給予 apocynin、catalase及 PD98059處理后，G1期增加，S期降低，說明這3種藥物可抑制AngⅡ的促細(xì)胞增殖效應(yīng)（P ＜ 0.05），見表 2，圖 2。

表2 藥物干預(yù)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程的影響（±s）Tab.2 Ef f ecton VSM C cycl e progressi on w i t h AngⅡt reat m entat di f f erentconcent rat i ons（±s）Group G1 S Control 58.02±0.29 37.40±0.72 AngⅡ 49.37±1.231） 45.62±0.351）AngⅡ+apocynin 55.93±0.472） 41.84±0.452）AngⅡ+catalase 54.19±1.072） 43.04±0.312）AngⅡ+PD98059 57.59±0.082） 40.89±0.282）1）P<0.05 vs control group；2）P<0.05 vs AngⅡgroup.

2.5 NADPH氧化酶抑制劑、過氧化氫酶及ERK1/2抑制劑對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖時(shí)H2O2、HOCL的影響

以AngⅡ終濃度100 nmol/L 24 h處理平滑肌細(xì)胞后，采用比色法檢測(cè)H2O2、HOCL水平，結(jié)果顯示在 AngⅡ處理組 H2O2水平［（1.223±0.255）mmol/L］顯著高于對(duì)照組［0.362±0.032）mmol/L］（P ＜ 0.05），預(yù)先給予apocynin、catalase與單用AngⅡ比較H2O2水平分別為（0.680±0.020）mmol/L、（0.315±0.034）mmol/L（P ＜ 0.05）；而 PD98059 為（1.040±0.161）mmol/L，對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)H2O2生成無明顯影響（P＞0.05）。

在AngⅡ處理組HOCL OD值為0.101±0.003，顯著高于對(duì)照組（0.038±0.004，P ＜ 0.05），預(yù)先給予apocynin、catalase與單用AngⅡ比較HOCL OD值分別降至 0.078±0.001、0.036±0.010，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；而 PD98059（0.092±0.004）對(duì) AngⅡ誘導(dǎo)的HOCL生成無明顯影響（P＞0.05）。

3 討論

3.1 AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AngⅡ處理后可促使VSMC增殖，同時(shí)伴有ROS增高，說明在AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖過程中，ROS可能參與其中。適量ROS是維持細(xì)胞生長(zhǎng)和機(jī)體抗感染所必需的，但過量ROS可對(duì)機(jī)體造成病理生理損害［6］。本實(shí)驗(yàn)中AngⅡ處理組較正常組ROS水平增高。ROS是調(diào)節(jié)VSMC增殖、肥大和遷移的重要信號(hào)分子［7］。在我們之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，已證實(shí)PVAT可產(chǎn)生AngⅡ，并與高血壓血管重構(gòu)相關(guān)［8］。近年來，ROS被證明為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖［9，10］。因此推斷在 PVAT AngⅡ誘導(dǎo)高血壓血管重構(gòu)的機(jī)制中ROS作為信號(hào)分子參與其中。ROS可激活特異性的信號(hào)傳導(dǎo)途徑、協(xié)調(diào)病理生理反應(yīng)、打開細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響血管重構(gòu)時(shí)細(xì)胞進(jìn)程［11］。

3.2 ROS介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖的機(jī)制

在AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖的過程中，何種ROS在激活氧化還原信號(hào)途徑中起主要作用尚不清楚。大多數(shù) ROS（如 O2-、OH-、ONOO-等）性質(zhì)高度活潑，極不穩(wěn)定。相對(duì)而言，H2O2比較穩(wěn)定，且容易在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間擴(kuò)散，因此H2O2極可能是啟動(dòng)氧化還原信號(hào)途徑的分子。在本實(shí)驗(yàn)中，AngⅡ處理后在明顯誘導(dǎo)VSMC增生的同時(shí)，H2O2水平也隨著明顯升高，在給予 apocynin及 catalase后，AngⅡ誘導(dǎo)VSMC的增殖能力下降，并且H2O2水平亦顯著下降，提示H2O2為AngⅡ效應(yīng)分子，且為 VADPH氧化酶（Nox）源性。這與很多研究中認(rèn)為H2O2作為主要效應(yīng)分子介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖以及血管重構(gòu)的結(jié)果一致［12～14］。當(dāng)H2O2在細(xì)胞內(nèi)大量堆積時(shí)，可能會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)氧化還原信號(hào)多條途徑，生成大量HOCL等化學(xué)物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中，AngⅡ在誘導(dǎo)VSMC增殖的同時(shí)，同樣亦有HOCL的明顯升高，在預(yù)先給予apocynin及catalase后，這兩種效應(yīng)同時(shí)降低，提示HOCL參與了AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖的過程。研究報(bào)道，HOCL能促使ERK1/2磷酸化而誘導(dǎo)血管VSMC遷移，從而在血管重構(gòu)中起著重要作用，而抗氧化劑和ERK1/2抑制劑能逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)［15］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在給予apocynin及catalase后，AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞增殖能力下降的同時(shí)，H2O2及HOCL水平亦下降，而PD98059雖能抑制細(xì)胞增殖，卻未能降低H2O2及HOCL的水平，提示AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖過程中的機(jī)制涉及Nox/H2O2/HOCL/ERK1/2途徑。

綜上所述，ROS在介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)VSMC增殖的過程中起著重要作用。以NADPH氧化酶源的H2O2為底物生成HOCL，從而激活ERK1/2，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖，這為PVAT與血管重構(gòu)的相關(guān)性研究提供了依據(jù)。

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