結(jié)核桿菌Th優(yōu)勢(shì)表位肽促進(jìn)人DC成熟及T細(xì)胞分化的研究

汪夢(mèng)真 周宇 李翠 李可意 李世杰 洪亮 黃新亮

摘要：目的：探究DC負(fù)載Th優(yōu)勢(shì)表位肽促進(jìn)人DC成熟及T細(xì)胞分化。方法：分離外周靜脈血得單核細(xì)胞、以細(xì)胞因子IL-4和GM-CSF刺激獲得DC，實(shí)驗(yàn)組以DC負(fù)載結(jié)核桿菌的Th優(yōu)勢(shì)表位肽（10 ug/mL）制備疫苗、對(duì)照組DC不負(fù)載表位肽，培養(yǎng)8天后流式儀鑒定DC的成熟度（表達(dá)CD40、CD80、HLA-DR的DC百分率）。各組DC和自身淋巴細(xì)胞按照1：20比例混合4天后，以流式儀鑒定T細(xì)胞首次分化的效應(yīng)CD4+T。再以Th優(yōu)勢(shì)表位肽刺激淋巴細(xì)胞2天后流式儀鑒定T細(xì)胞再次分化的效應(yīng)CD4+T。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組表達(dá)CD40、CD80、HLA-DR的DC細(xì)胞百分率升高，差異有顯著性（p<0.05）;T細(xì)胞首次分化的效應(yīng)CD4+T百分率、T細(xì)胞再次分化的效應(yīng)CD4+T百分率升高，差異有顯著性（p<0.05）;且T細(xì)胞再次分化的效應(yīng)CD4+T比T細(xì)胞首次分化的效應(yīng)CD4+T百分率升高，差異有顯著性（p<0.05）。結(jié)論：結(jié)核桿菌Th優(yōu)勢(shì)表位肽刺激人DC后，能促進(jìn)人DC成熟及T細(xì)胞分化。

關(guān)鍵詞：結(jié)核病;樹突狀細(xì)胞;表位肽;淋巴細(xì)胞;疫苗

【中圖分類號(hào)】 R52 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306（2022）12--02

結(jié)核分枝桿菌（MTB）是引起結(jié)核病的病原體，結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性感染性疾病。自2006年以來全世界每年有近900萬或以上的新發(fā)病例，2014年全球新發(fā)結(jié)核病人960萬人，死亡150萬人。我國(guó)是22個(gè)結(jié)核病高發(fā)國(guó)家之一，患病人數(shù)位居全球第二[1]。近年來，由于人口流動(dòng)加速、免疫抑制藥廣泛應(yīng)用、艾滋病的不斷蔓延及卡介苗免疫效率低下等，我國(guó)結(jié)核病的發(fā)病率依然居高不下，發(fā)病總?cè)藬?shù)呈現(xiàn)上升勢(shì)頭，結(jié)核病疫情形勢(shì)非常嚴(yán)峻[2]。全球近1/3人感染MTB，其中有90%的人處于潛伏感染狀態(tài)。

目前仍不清楚結(jié)核桿菌誘導(dǎo)的確切免疫機(jī)制。已知記憶性T淋巴細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞膜分子CD45RO和某些粘附分子;記憶性T細(xì)胞再次遇到同一抗原時(shí)，能夠產(chǎn)生快速而強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，在抵抗微生物感染和抗腫瘤中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用;它比非記憶細(xì)胞免疫功能更強(qiáng)大且壽命更長(zhǎng)，是機(jī)體抗結(jié)核免疫的基礎(chǔ)，但其確切的免疫機(jī)制尚不清楚[3，4]?，F(xiàn)在臨床實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)核桿菌感染的結(jié)核桿菌標(biāo)本陽(yáng)性率不高;常規(guī)為結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)，由于采用純化蛋白衍生物作為抗原，包括卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌抗原存在廣泛交叉反應(yīng)而且檢測(cè)結(jié)果有較高的假陽(yáng)性和假陰性[5]從而限制TST的臨床廣泛應(yīng)用。診斷結(jié)核感染的另一種常用方法是結(jié)核特異性T細(xì)胞免疫γ-干擾素釋放試驗(yàn)，但其診斷的敏感性與特異性差異較大，且試劑價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜[6-7]。

綜上，疫苗仍是控制結(jié)核病流行的最佳策略[1]：亞單位疫苗的保護(hù)效果優(yōu)于卡介苗、將可能成為卡介苗的理想替代品[8]。已知結(jié)核桿菌有多種抗原表位肽，查詢最近的結(jié)核數(shù)據(jù)庫(kù)、表位數(shù)據(jù)庫(kù)、HLA基因頻率數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，Rv0934（350-364）的表位QVHFQPLPPAVVKL（表位肽2）屬于HLA-DRB1*0901限制性Th細(xì)胞表位，而HLA-DRB1*0901等位基因在中國(guó)人群頻率最高，能夠覆蓋最廣泛的中國(guó)人群。利用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)到了表位肽2夠誘導(dǎo)肺結(jié)核患者產(chǎn)生同時(shí)分泌兩種或以上細(xì)胞因子的多功能CD4+T細(xì)胞。且這種表位肽能激發(fā)更強(qiáng)大的免疫效應(yīng)，成為優(yōu)勢(shì)表位肽[9]。確定T細(xì)胞表位，對(duì)表位疫苗設(shè)計(jì)、結(jié)核診斷試劑開發(fā)具有十分重要的意義[1]。目前樹突狀細(xì)胞（DC）的無動(dòng)物血清培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成熟。德國(guó)美因茨大學(xué)（Mainz University）的Jonuleit等發(fā)現(xiàn)TNF-a、IL-1b和IL-6 3種CK（細(xì)胞因子）組合后，在無牛血清培養(yǎng)體系中能夠?qū)⑽闯墒霥C誘導(dǎo)成完全成熟的DC，避免了動(dòng)物血清培養(yǎng)DC對(duì)人產(chǎn)生的毒副作用[3，9]。本文以DC負(fù)載結(jié)核桿菌優(yōu)勢(shì)表位肽為基礎(chǔ)，進(jìn)一步總結(jié)其促進(jìn)人DC成熟及T細(xì)胞分化功能，以期深入探究結(jié)核病的新型防治措施。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各6例，平均年齡21歲，經(jīng)健康體檢無其他發(fā)病史，兩組年齡及性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.2主要試劑人外周靜脈血、無血清AIM-V培養(yǎng)液、DC表面標(biāo)志分子CD40、CD80、HLA-DR的熒光素PE標(biāo)記抗、IL-2、IL-4、IL-1b、TNF-α、IL-6、GM-CSF、FITC熒光素標(biāo)記的抗人CD3單克隆抗體和PE標(biāo)記的抗人CD4抗體（Biolegend公司）、Th優(yōu)勢(shì)表位肽DQVHFQPLPPAVVKL（武漢強(qiáng)耀生物科技有限公司合成）。

1.2方法

1.2.1制備DC疫苗

取實(shí)驗(yàn)組外周靜脈血分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞，并置于6孔板中，在37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h;6孔板中貼壁的為DC（收集未貼壁的細(xì)胞并且凍存，以便后期和DC混合培養(yǎng)）。向6孔板中加入100 ng/mL GM-CSF、100 ng/mL IL-4，加3 mL/孔無血清AIM-V培液。第3天DC中加入Th優(yōu)勢(shì)表位肽（10 ug/mL），并加入：TNF-a 10 ng/mL、IL-1b 10 ng/mL、IL-6 1000 U/mL。對(duì)照組以DC為對(duì)照，不加入Th優(yōu)勢(shì)表位肽，其余步驟相同。

1.2.2 DC負(fù)載Th優(yōu)勢(shì)表位肽疫苗的成熟度鑒定

倒置顯微鏡觀察DC疫苗的形態(tài)變化、用臺(tái)盼藍(lán)染色檢查細(xì)胞存活率。收集第8天的DC并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組DC表面標(biāo)志分子CD40、CD80、HLA-DR。

1.2.3 T細(xì)胞的活化

各組DC計(jì)數(shù)，以1×106/mL作為刺激細(xì)胞，按DC：淋巴細(xì)胞=1：20的比例，讓DC和復(fù)蘇凍存的淋巴細(xì)胞混合，37℃置于5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。

1.2.4 T細(xì)胞分化的鑒定

倒置顯微鏡觀察淋巴細(xì)胞的形態(tài)變化、用臺(tái)盼藍(lán)染色檢查淋巴細(xì)胞存活率。檢測(cè)各組CD4+T細(xì)胞百分率：在每孔100 uL PBMC細(xì)胞懸液中，加入5 uL PE標(biāo)記的抗人CD3克隆抗體、5 uL FITC標(biāo)記抗人CD4單克隆抗體，4℃避光染色30 min，以流式細(xì)胞儀C6檢測(cè)。

1.2.5再次誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化

對(duì)各組再次誘導(dǎo)自身淋巴細(xì)胞：以微量移液管加Th優(yōu)勢(shì)表位肽10 ug/mL于細(xì)胞中培養(yǎng)2天。

1.2.6再次誘導(dǎo)后分化的淋巴細(xì)胞的鑒定

以倒置顯微鏡觀察淋巴細(xì)胞的形態(tài)變化、用臺(tái)盼藍(lán)染色檢查淋巴細(xì)胞存活率，并以流式細(xì)胞儀C6檢測(cè)各組CD4+T細(xì)胞百分率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，SPSS17統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組表達(dá)CD40、CD80、HLA-DR的DC百分率

實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組表達(dá)CD40、CD80、HLA-DR的DC百分率顯著升高（p<0.05）。見表1，實(shí)例如圖1。DC形態(tài)實(shí)例如圖2。

2.2實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組T細(xì)胞首次分化的效應(yīng)CD4+T百分率

實(shí)驗(yàn)組DC首次誘導(dǎo)的效應(yīng)CD4+T百分率（即實(shí)驗(yàn)組T細(xì)胞首次分化的效應(yīng)CD4+T百分率）比對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。見圖3。實(shí)例如圖3。CD4+T形態(tài)如圖5。

2.3實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組T細(xì)胞再次分化的效應(yīng)CD4+T

實(shí)驗(yàn)組DC再次誘導(dǎo)的效應(yīng)CD4+T百分率（即實(shí)驗(yàn)組T細(xì)胞再次分化的效應(yīng)CD4+T百分率）比對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。見圖6，實(shí)例如圖7。CD4+T形態(tài)如圖8。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組DC再次誘導(dǎo)的效應(yīng)CD4+T百分率的參考值見表2。

2.4 T細(xì)胞再次分化的效應(yīng)CD4+T百分率和首次分化的效應(yīng)CD4+T百分率

DC再次誘導(dǎo)的效應(yīng)CD4+T百分率比首次誘導(dǎo)的效應(yīng)CD4+T百分率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。見圖9。

3討論

目前DC的無動(dòng)物血清培養(yǎng)技術(shù)業(yè)已成熟，防治結(jié)核病的新型疫苗適宜在無動(dòng)物血清培養(yǎng)技術(shù)下進(jìn)行制備。以TNF-a、IL-1b和IL-6三種細(xì)胞因子組合后，在無牛血清培養(yǎng)體系中能夠?qū)⑽闯墒霥C誘導(dǎo)成完全成熟的DC，避免了動(dòng)物血清培養(yǎng)DC對(duì)人產(chǎn)生的毒副作用[8]。Th優(yōu)勢(shì)表位肽是結(jié)核桿菌抗原Rv0934（350-364）的表位肽DQVHFQPLPPAVVKL、屬于HLA-DRB1*0901限制性Th細(xì)胞表位，能被CD4+T識(shí)別。而HLA基因頻率測(cè)試發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1*0901等位基因在中國(guó)人群的頻率最高。因此，疫苗一旦開發(fā)成功，適用人群廣泛。因而本研究為體外構(gòu)建結(jié)核疫苗提供了方便的安全的培養(yǎng)環(huán)境。

結(jié)核病的免疫機(jī)制中可能存在多種Th細(xì)胞的活化、分化和效應(yīng)[3]。本文總結(jié)了檢測(cè)CD4+T細(xì)胞的體外簡(jiǎn)易方法，若進(jìn)一步通過臨床研究、制定DC再次誘導(dǎo)后的CD4+T細(xì)胞的數(shù)量參考值范圍，亦可據(jù)此評(píng)估患者的免疫功能。例如已知結(jié)核病為有菌免疫，若受檢者該百分率高于正常值，可作為個(gè)體免疫功能增強(qiáng)及結(jié)核病的病因?qū)W診斷的依據(jù);還可據(jù)此判斷個(gè)體結(jié)核病預(yù)防或治療效果的動(dòng)態(tài)變化。

結(jié)束語

綜上，結(jié)核桿菌Th優(yōu)勢(shì)表位肽刺激DC，能促使DC細(xì)胞成熟度增加，DC負(fù)載的結(jié)核桿菌Th優(yōu)勢(shì)表位肽誘導(dǎo)T細(xì)胞分化為效應(yīng)CD4+T百分率上升、且再次誘導(dǎo)的效應(yīng)CD4+T比DC首次誘導(dǎo)的效應(yīng)CD4+T百分率升高。據(jù)此有望探索出基于臨床前期結(jié)核病的新型防治方法：用DC負(fù)載結(jié)核桿菌Th優(yōu)勢(shì)表位肽的疫苗誘導(dǎo)外周血中T細(xì)胞，能增強(qiáng)機(jī)體抗結(jié)核桿菌的細(xì)胞免疫功能。

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基金項(xiàng)目：2021年安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202110368043）

作者簡(jiǎn)介：汪夢(mèng)真（2002-01）女，漢，安徽，本科學(xué)生，研究方向：衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫。