人冠狀病毒與人類呼吸道感染

沈 軍 俞 蕙 朱啟镕

·綜述·

人冠狀病毒與人類呼吸道感染

沈 軍 俞 蕙 朱啟镕

21世紀(jì)初10余年，新型及變異人類呼吸道病毒已多次威脅全球人類。2012年9月25日， WHO發(fā)布3天前在英國確診的1例新型冠狀病毒致命性感染病例，并認(rèn)為該病例與不久前在沙特阿拉伯的1例新型冠狀病毒致命性感染相關(guān)，新型人冠狀病毒(HCoV)致命性感染人類再次發(fā)生[1]。隨即這種新型HCoV的全基因序列在GenBank中被公布，新的冠狀病毒被命名為HCoV-EMC/2012[2]。基于病毒upstream of the E gene (upE)和open reading frame (ORF)1b兩個(gè)基因片段的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法的文獻(xiàn)于2012年9月27日在歐洲監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)發(fā)表[3]。與所有已知的病毒核苷酸同源性比較，HCoV-EMC/2012同蝙蝠冠狀病毒HKU4和HKU5同源性最高[4～7]。截至2013年3月23日，WHO共確認(rèn)16例HCoV-EMC/2012感染病例(表1)，其中有9例死于重癥肺炎(其中至少4例合并腎功能衰竭)[8,9]；HCoV-EMC/2012病毒分離于1例60歲死亡沙特阿拉伯男性痰液標(biāo)本中[3～5]。最初10例確診病例基于流行病學(xué)信息分為兩組，分別來源于沙特阿拉伯、約旦和卡塔爾，提示這種病毒可能存在人與人之間傳播；第11、12例患者在英國發(fā)病，發(fā)病前沒有疫區(qū)的旅游史，但與從沙特阿拉伯旅游回英國的第10例屬同一家庭成員，進(jìn)一步提示HCoV-EMC/2012能夠在人與人間傳播，引起人們對(duì)HCoV-EMC/2012在人群中廣泛流行的擔(dān)憂[10～14]；第13例患者2013年1月在沙特阿拉伯發(fā)病并于同年2月死亡，在2013年2月分別又有2例沙特阿拉伯患者發(fā)病死亡，第16例沙特阿拉伯患者僅有輕微的呼吸道癥狀[8]，與2012年4月回溯性確認(rèn)的HCoV-EMC/2012首次在人群中流行有間隔11個(gè)月之久[15]，提示HCoV-EMC/2012在人群中可能長(zhǎng)期潛伏或流行，或者從動(dòng)物源性的寄生宿主間歇性地傳播到人群[6,7,9,16～19]。鑒于2002至2003年SARS的致命性短暫全球流行[20]，HCoV的變異與流行再次成為研究與討論的熱點(diǎn)。本文就HCoV致人類呼吸道感染及病毒基因變異和進(jìn)化進(jìn)行綜述，并根據(jù)GenBank中已知的HCoV基因序列運(yùn)用MEGA5.1軟件進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析，以展現(xiàn)HCoV-EMC/2012與之前已知的5種HCoV的親緣關(guān)系，為進(jìn)一步了解HCoV與人類呼吸道感染的關(guān)系提供幫助。

注 例11和12無旅游史，提示在英國感染；腎衰：腎功能衰竭

1 6種HCoV

HCoV最早被發(fā)現(xiàn)是在20世紀(jì)60年代(HCoV-229E和HCoV-OC43)，是已知自然界中最長(zhǎng)序列RNA病毒，其單股正鏈基因序列長(zhǎng)達(dá)26～32 kb，能夠引起人類和動(dòng)物呼吸道、消化道和神經(jīng)系統(tǒng)感染[21,22]。2002至2003年在全球致命性流行的人SARS冠狀病毒(SARS-CoV)由于在人群中從未有流行，故人群普遍易感，感染后死亡率非常高，全球共確診8 422例病例，死亡916例[23,24]。 2004年荷蘭學(xué)者van der Hoek等[25]從1名7月齡的支氣管炎兒童呼吸道標(biāo)本中分離到另一種新的冠狀病毒：HCoV-NL63 ；2005年Woo等[26]在香港從1名71歲老年人呼吸道中發(fā)現(xiàn)第5種HCoV ，即HCoV-HKU1；隨后的血清學(xué)方法證明在3.5歲以下兒童中，大部分已感染過HCoV-229E和HCoV-NL63并產(chǎn)生抗體[27],，50歲以上人群4種HCoV血清學(xué)陽性率均在90%以上[28]，證實(shí)4種非SARS-HCoVs在人群中有長(zhǎng)期普遍流行。4種非SARS-HCoVs臨床多表現(xiàn)為亞臨床感染或輕度呼吸道感染，但在兒童、老年人、免疫功能抑制等人群中可致重癥呼吸道感染[29～31]。

根據(jù)基因的進(jìn)化樹分析，自然界的冠狀病毒分為4組，人冠狀病毒分屬于其中的2組：HCoV-229E和HCoV-NL63屬于α組，HCoV-OC43和HCoV-HKU1屬于β組A亞組，而SARS-CoV屬于β組B亞組，γ組和δ組的冠狀病毒目前還是動(dòng)物源性，如在牛、蝙蝠、果子貍、鳥類等中循環(huán)流行[32]。所有冠狀病毒都有一個(gè)共同的基因組結(jié)構(gòu)；其中復(fù)制酶基因包括了5′總基因組的2/3，是由兩個(gè)重疊的開放閱讀框(ORFs)即ORF1a和ORF1b組成；結(jié)構(gòu)基因覆蓋了3′總基因組的1/3，以規(guī)范的順序編碼結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)基因，即5′-spike(S)-envelope(E)-membrane(M)-nucleocapsid(N)-3′；β組的一些冠狀病毒還在ORF1b和S基因之間攜帶額外的結(jié)構(gòu)蛋白基因，編碼血凝素酯酶。在基因進(jìn)化樹中，HCoV中只有HCoV-229E和HCoV-NL63有比較密切的聯(lián)系；HCoV-OC43與牛、豬和馬的冠狀病毒緊密聯(lián)系；人SARS冠狀病毒來源于動(dòng)物源性，與果子貍和蝙蝠的SARS冠狀病毒非常近緣[32,33]。 根據(jù)對(duì)HCoV-EMC/2012全基因序列分析發(fā)現(xiàn)，其與蝙蝠的冠狀病毒(BtCoV-HKU4和 BtCoV-HKU5)同屬β組C亞組，為從未所知的新型HCoV，是第6種HCoV[5]。HCoV-EMC/2012與其他冠狀病毒基于Spike基因序列的進(jìn)化樹分析見圖1。

圖1 HCoV-EMC/2012與其他冠狀病毒進(jìn)化樹

注 HCoV-EMC/2012, human betacoronavirus 2c EMC/2012 (JX869059); HCoV-HKU1, human coronavirus HKU1 (NC_006577); Ty-BatCoV-HKU4, Tylonycteris bat coronavirus HKU4 (NC_009019); Pi-BatCoV-HKU5, Pipistrellus bat coronavirus HKU5 (NC_009020); SARS CoV, SARS-related human coronavirus(NC_004718); HCoV-OC43, human coronavirus OC43 (NC_005147); MHV, murine hepatitis virus(NC_001846); Ro-BatCoV-HKU9, Rousettus bat coronavirus HKU9 (NC_009021); SARSr-Rh-BatCoV HKU3, SARS-related Rhinolophus bat coronavirus HKU3 (DQ022305); BWCoV-SW1, beluga whale coronavirus SW1 (NC_010646); IBV-partridge, partridge coronavirus (AY646283); MunCoV HKU13, munia coronavirus HKU13 (FJ376622); CMCoV HKU21, common moorhen coronavirus HKU21 (NC_016996); ThCoV HKU12, thrush coronavirus HKU12 (FJ376621); HCoV-229E, human coronavirus 229E (NC_002645); HCoV-NL63, human coronavirus NL63 (NC_005831); PEDV, porcine epidemic diarrhoea virus (NC_003436); Sc-BatCoV 512, Scotophilus bat coronavirus 512 (NC_009657); Mi-BatCoV HKU8, Miniopterus bat coronavirus HKU8 (NC_010438); Mi-BatCoV 1A, Miniopterus bat coronavirus 1A (NC_010437), TCoV, turkey coronavirus (NC_010800)

2 HCoV的基因變異與進(jìn)化

根據(jù)分子鐘(Molecular clock)的計(jì)算分析，HCoV-229E和HCoV-NL63在1 000年前來源于一個(gè)共同的祖先[34]，HCoV-229E與蝙蝠GhanaBt-CoVGrp1在公元前1686至1800年有共同的祖先，人SARS-CoV與蝙蝠GhanaBt-CoVGrp2在2 400年前來源于同一株病毒[35]，而與果子貍SARS-CoV最近的共同祖先就在1999至2002年[36]。并且，所有的冠狀病毒在公元前8100年有共同祖先；α、β、γ和δ組冠狀病毒分別在公元前2400年、公元前3300年、公元前2800年和公元前3000年開始有不同的進(jìn)化枝；蝙蝠與鳥類這些飛行的溫血?jiǎng)游锸枪跔畈《纠硐氲乃拗鳎?、β組冠狀病毒依托蝙蝠，γ和δ組冠狀病毒依托鳥類加速進(jìn)化和傳播[32,37]。

從實(shí)驗(yàn)室到自然界研究都已經(jīng)證實(shí)，所有的冠狀病毒都有高度的基因變異率，在2種不同基因型的病毒株感染同一細(xì)胞時(shí)，病毒基因能夠重組[32,38]。即意味著在理論上，目前全球流行的普通HCoV及只感染一些動(dòng)物的冠狀病毒，可能存在與SARS類似的情況，即病毒基因進(jìn)行重組變異產(chǎn)生新的毒株，導(dǎo)致不可預(yù)見的流行宿主范圍和致病性。目前為止已發(fā)現(xiàn)兩種動(dòng)物源性冠狀病毒到人類傳播的情況，即屬于β組B亞組的SARS-CoV從蝙蝠到人類的傳播[36,39]，以及屬于β組A亞組的牛冠狀病毒到HCoV-OC43在人類的傳播[32,40]。而流行病毒株適應(yīng)生存與持續(xù)傳播，其基因也必然在持續(xù)的變異之中，有時(shí)即使單個(gè)核苷酸的變異也有可能導(dǎo)致病毒毒力的改變[41-45]；當(dāng)病毒基因核苷酸存在較大的異質(zhì)性時(shí)，甚至通過基因重組，出現(xiàn)新的基因型流行株[41,44,45]。冠狀病毒具有高度基因突變率的主要原因有：①RNA依賴的RNA聚合酶基因(Pol)多變，自然變異率為每年每1/1 000～1/10 000核苷酸位點(diǎn)發(fā)生替換；②RNA依賴的RNA聚合酶高頻率的同源性RNA重組；③冠狀病毒基因組大，提供了其較其他病毒有額外的可塑性[32, 43]。由于冠狀病毒多見與其他病毒混合感染(包括不同型/亞型的冠狀病毒之間)，有利于同源性及異源性基因重組。最近的研究發(fā)現(xiàn)，牛冠狀病毒在感染宿主過程中病毒基因能夠發(fā)生變異和篩選以適應(yīng)宿主環(huán)境并可能導(dǎo)致跨宿主感染發(fā)生[45]。這次新發(fā)現(xiàn)HCoV-EMC/2012全基因序列分析與蝙蝠冠狀病毒HKU4和HKU5核苷酸同源性最高(β組C亞組)，與兩者在ORF1ab的七段保守區(qū)域核苷酸同源性分別為75%和77%(均遠(yuǎn)離判斷為同種病毒的90%核苷酸同源性標(biāo)準(zhǔn))；HCoV-EMC/2012與SARS-CoV同屬β組，但兩者分屬C和A亞基因組，兩者之間同源性較低[5,6]。HCoV-EMC/2012是否從動(dòng)物源性冠狀病毒跨種族間感染，或者是既往流行病毒株發(fā)生基因變異或重組后形成新的病毒株導(dǎo)致人類致命性感染，目前尚未可知[5,6,9,16～19]。

3 宿主病毒受體與冠狀病毒的傳播

HCoV-EMC/2012的宿主細(xì)胞受體尚未完全明確，但已知這種新的病毒并未如SARS-CoV以人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶受體2(hACE2)作為感染宿主的受體。尤為重要的是，HCoV-EMC/2012能夠感染蝙蝠、豬和人類細(xì)胞，提示這種病毒也許以3種物種共有的受體分子感染宿主細(xì)胞，暗示病毒能夠在3種物種間跨物種傳播[16]。如A型流感病毒H5N1進(jìn)入細(xì)胞需要末端有α2，3唾液酸結(jié)構(gòu)的多糖受體，而人類的A型流感病毒株需要α2，6唾液酸結(jié)構(gòu)；末端有α2，3唾液酸結(jié)構(gòu)的多糖受體在人類呼吸道很少且僅局限于下呼吸道，也就是這種病毒在人群中很難流行的原因。需要指出的是，牛冠狀病毒和HCoV-OC43是以結(jié)合唾液酸受體侵入宿主細(xì)胞。目前僅有16例HCoV-EMC/2012確診病例，人與人之間傳播證據(jù)不足，提示病毒可能也以主要存在于人類下呼吸道的某種蛋白為受體感染人類[26,46]。這樣的例子猶如SARS-CoV，由于hACE2大量存在于人體的肺部，而在上呼吸道很少，所以大部分SARS-CoV感染患者在發(fā)展為肺炎時(shí)才有傳染性[47,48]。另外，與SARS-CoV主要引起肺炎不同，HCoV-EMC/2012感染多有腎功能衰竭，提示在人類腎臟也有病毒受體[17,46,49]。冠狀病毒的Spike蛋白主要存在于病毒表面，決定了病毒的宿主范圍和組織特異性，也是病毒的抗體中和位點(diǎn)[50,51]。對(duì)Spike蛋白結(jié)構(gòu)與功能的研究，對(duì)尋找病毒受體及深入理解病毒致病機(jī)制、疫苗研究非常重要。有研究通過對(duì)SARS-CoV的Spike蛋白結(jié)構(gòu)推算，認(rèn)為HCoV-EMC/2012的Spike蛋白也同樣可能是受體結(jié)合位點(diǎn)(RBD)及重要抗體中和位點(diǎn)(CND)[52]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，HCoV-EMC/2012的Spike蛋白能被宿主細(xì)胞的跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)激活而融合宿主細(xì)胞，并且HCoV-EMC/2012感染宿主細(xì)胞的Spike蛋白受體確實(shí)與已知的冠狀病毒受體(hACE2、CD13和CEACAM1)不同；在來源于不同組織(包括肺、腎和結(jié)腸)的人類細(xì)胞培養(yǎng)體系中，HCoV-EMC/2012都能感染細(xì)胞產(chǎn)生溶細(xì)胞作用，提示這種病毒可以有呼吸道以外的途徑進(jìn)行傳播。更為重要的是，研究證實(shí)HCoV-EMC/2012的Spike蛋白如同其他的冠狀病毒Spike蛋白一樣，是主要的中和抗體的靶蛋白，能夠被從1名病毒感染的患者血清分離到的Spike蛋白特異性中和抗體結(jié)合，使病毒失去感染細(xì)胞的能力[4,16,18,46]。

4 對(duì)冠狀病毒在人群中流行的監(jiān)測(cè)、預(yù)警和控制

從2003年SARS病毒的不同尋常的出現(xiàn)及隨后史無前例的全球感染協(xié)作控制的成功，為高度警惕臨床不明原因的致命性呼吸道感染病例個(gè)體事件的出現(xiàn)提供了依據(jù)。在HCoV-EMC/2012感染被確認(rèn)后，2012年9月26日WHO即發(fā)布了全球新型冠狀病毒預(yù)防和控制指南，隨后發(fā)布了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指導(dǎo)、實(shí)驗(yàn)室生物危害管理技術(shù)指導(dǎo)、新型冠狀病毒感染病例定義、感染流行監(jiān)視指導(dǎo)和臨床處理建議[53]。英國衛(wèi)生防護(hù)局(HAP)也有相應(yīng)的預(yù)防指南發(fā)布[54]。根據(jù)WHO指南，對(duì)集體性急性重癥呼吸道感染(SARI)和其他異常感染及流行狀況進(jìn)行全球密切監(jiān)測(cè)；建議對(duì)有不能解釋病因的肺炎、重癥進(jìn)展性或?qū)χ委煙o反應(yīng)的呼吸道疾病患者要考慮HCoV-EMC/2012感染可能，尤其對(duì)有疫區(qū)旅游史的患者；對(duì)全球任何地方發(fā)生的衛(wèi)生工作人員中發(fā)生的集體性SARI進(jìn)行徹底的調(diào)查[8,55,56]。早在2012年4月，約旦發(fā)生了包括衛(wèi)生工作人員在內(nèi)的集體SARI事件[57]，在約旦衛(wèi)生部長(zhǎng)立即向WHO匯報(bào)后，WHO派遣美國海軍第三醫(yī)學(xué)研究處(NAMRU-3)的一隊(duì)小組進(jìn)行協(xié)助調(diào)查，但當(dāng)時(shí)未能找到病原；在2012年9月HCoV-EMC/2012被發(fā)現(xiàn)后，約旦將凍存的在2012年4月患者采集的標(biāo)本送NAMRU-3進(jìn)行檢測(cè)后，確認(rèn)了2例HCoV-EMC/2012感染死亡病例，由此揭示這種病毒在2012年4月起即已經(jīng)在人群中流行[58]。

通過對(duì)確診16例患者之間流行病學(xué)研究及對(duì)其他接觸人群進(jìn)行暴露后10天內(nèi)的病毒檢測(cè)及隨訪監(jiān)測(cè)，目前的信息認(rèn)為HCoV-EMC/2012能在人群中的傳播但傳染性并不強(qiáng)[6,13,14,59-61]。由于目前仍未確定這種病毒是否在發(fā)生變異后從動(dòng)物源性宿主跨物種傳播到人群，盡管在核苷酸同源性及進(jìn)化樹分析上提示可能來源于蝙蝠冠狀病毒HKU4和HKU5，病毒的儲(chǔ)存宿主或者可能的中間宿主(如牛、果子貍等)仍未能確定。病毒在向人群中或在人群中的傳播途徑、病毒的接種時(shí)間與排毒時(shí)間、病毒學(xué)機(jī)制、在人類中所致的疾病譜及發(fā)生重癥感染的危險(xiǎn)因素、人體感染病毒后的免疫反應(yīng)、可能的有效治療措施和感染控制策略等均有待于明確。由于SARS病毒能在體外干燥的物體表面存活2～3 d，在人糞便中存活2～4 d，接種時(shí)間為7～10 d，其他的HCoV接種時(shí)間為3～5 d[59,62,63]；故推測(cè)HCoV-EMC/2012的接種時(shí)間應(yīng)在10 d內(nèi)，WHO和HAP建議的感染控制措施是對(duì)暴露人群監(jiān)測(cè)至少10天，實(shí)施常規(guī)的接觸與空氣傳播預(yù)防措施，以及接觸動(dòng)物后的簡(jiǎn)單的個(gè)人手部衛(wèi)生措施[6,53,54,64]。

由于16例確診的患者在發(fā)病地點(diǎn)(在沙特阿拉伯、約旦、卡塔爾和英國均有病例被發(fā)現(xiàn))和時(shí)間上(2012年4月到2013年3月)跨度很大，是否HCoV-EMC/2012在人群中存在廣泛的無癥狀攜帶、亞臨床感染和輕癥感染有待于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查[6]。16例患者中有2例僅有輕度的呼吸道癥狀，提示輕癥感染可能也較為常見[8,56]。HCoV-EMC/2012是否如同SARS在兒童人群中導(dǎo)致感染癥狀較輕而未能被重視與及時(shí)發(fā)現(xiàn)，有待于對(duì)HCoV-EMC/2012流行人群的進(jìn)一步監(jiān)測(cè)[65]。另外，HCoV-EMC/2012由于是新出現(xiàn)的病毒，在人群中感染流行后是否發(fā)生變異以利于更適應(yīng)人體的環(huán)境導(dǎo)致更大范圍的流行，或者有利于人與人之間的傳播，必須在全球進(jìn)行密切協(xié)作監(jiān)控。

同時(shí)，必須對(duì)動(dòng)物界的冠狀病毒流行與變異情況、甚至新型冠狀病毒流行進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以應(yīng)對(duì)可能存在跨物種冠狀病毒流行[5,16,17,32,33,37,44,66,67]。HCoV-EMC/2012的出現(xiàn)，對(duì)HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和CoV-HKU1在人群中的流行及基因變異的可能影響，需要有密切的監(jiān)測(cè)。

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10.3969/j.issn.1673-5501.2013.02.000

上海市衛(wèi)生系統(tǒng)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目基金：08GWZX0102

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 上海，201102

朱啟镕，E-mail：qrzhu@shmu.edu.cn

2013-02-15

2013-03-27)

張崇凡)