吡格列酮對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制研究

萬政強(qiáng)，陳晨，伏林山，孫關(guān)

(鹽城市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇鹽城 224001)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，由于生長(zhǎng)位置特殊、惡性程度高以及血腦屏障的存在，目前臨床上膠質(zhì)瘤治療效果極差［1］。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors γ，PPARγ)的生物學(xué)功能復(fù)雜，參與調(diào)控脂肪和糖代謝、脂肪細(xì)胞終末分化、能量平衡，控制單核細(xì)胞分化成熟，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)排卵，抗肝纖維化和動(dòng)脈粥樣硬化，降血脂和血壓，并能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，抑制腫瘤血管生成［2］。近年來，PPARγ激動(dòng)劑的抗腫瘤作用成為研究熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用PPARγ激動(dòng)劑吡格列酮處理細(xì)胞，研究吡格列酮對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，TUNEL及CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，β 連環(huán)蛋白(β-catenin)、MMP-2、Bad、Bax一抗購自Santa Cruz公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司，吡格列酮購自美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 β-catenin反義寡聚核苷酸設(shè)計(jì)合成

β-catenin反義寡聚核苷酸由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成，其合成序列為5'-AAG TCC TGT ATG AGT GGG AAC-3'。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

各組細(xì)胞加吡格列酮處理后每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于 96孔培養(yǎng)板，加入培養(yǎng)液 100μl·孔-1，37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)24、48、72 h。檢測(cè)前4 h每孔加CCK-8溶液10μl，繼續(xù)孵育2～4 h，棄上清液，選擇490 nm波長(zhǎng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔吸光度值，取5孔的平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲

取90%融合度的U251細(xì)胞經(jīng)無血清DMEM同步化24 h，用無菌的移液管尖(約0.7 mm)在各培養(yǎng)板細(xì)胞生長(zhǎng)單層的相同位置劃直線，分別用含100μmol·L-1吡格列酮和DMSO的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞過夜。分別于劃痕后12、24 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍攝(×40)。

1.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

各組細(xì)胞加吡格列酮處理后固定液固定細(xì)胞30 min，加配制好的 TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60 min，抗熒光淬滅劑封片后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.7 Western Blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞處理后收集細(xì)胞，RIPA裂解液裂解，收獲蛋白并行BCA法定量，40μg蛋白上樣于10%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜并用5%脫脂奶粉于37℃條件下封閉1 h，一抗(β-catenin、MMP-2、Bad、Bax 1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，HRP 標(biāo)記的二抗孵育1.5 h，以β-actin作為內(nèi)參，將超敏發(fā)光液加在PVDF膜上，曝光顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行常規(guī)統(tǒng)計(jì)，行t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 吡格列酮對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

選擇U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株分別給予不同濃度吡格列酮(1、10、50、100、200 μmol·L-1)處理 1、3、5、7 d，采用CCK-8法檢測(cè)吡格列酮對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活力的影響。如圖1所示:1、10、50 μmol·L-1的吡格列酮對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)無明顯抑制作用，100μmol·L-1的吡格列酮作用3 d后U251細(xì)胞增殖活力降至(54.6±2.8)%，且隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖能力逐漸降低。將藥物濃度增加至200μmol·L-1后，U251細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制。結(jié)果表明吡格列酮能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且隨藥物濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞活力逐漸降低，呈藥物濃度-時(shí)間負(fù)性依賴方式。

圖1 CCK-8法顯示吡格列酮抑制U251細(xì)胞增殖，并呈時(shí)間-劑量依賴性

2.2 吡格列酮抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲

劃痕損傷形成傷口模型后，劃痕邊緣的細(xì)胞以出芽的方式向外生長(zhǎng)，導(dǎo)致傷口面積逐漸縮小。損傷24 h后，對(duì)照組約有80%的傷口面積重新融合，而吡格列酮組的傷口面積幾乎沒有改變。Western Blot檢測(cè)顯示，吡格列酮能顯著降低MMP-2的蛋白表達(dá)(P＜0.05)(圖2)，提示吡格列酮能增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的黏附性，抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

圖2 A.劃痕試驗(yàn)顯示吡格列酮抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞侵襲;B.吡格列酮抑制MMP-2蛋白表達(dá)

2.3 吡格列酮對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL法發(fā)現(xiàn)吡格列酮處理細(xì)胞24 h后，顯微鏡下綠色熒光陽性細(xì)胞顯著多于對(duì)照組，提示吡格列酮能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。同時(shí)，U251細(xì)胞中凋亡誘導(dǎo)蛋白Bad、Bax表達(dá)均上調(diào)，與對(duì)照組相比均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3)。結(jié)果表明，吡格列酮能夠促使膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡顯著增加。

2.4 吡格列酮抑制β-catenin蛋白表達(dá)水平

Western Blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)吡格列酮處理U251細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平逐漸降低，呈濃度-時(shí)間依賴方式(圖4)。

2.5 β-catenin siRNA抑制相關(guān)基因表達(dá)

U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染β-catenin反義寡聚核苷酸發(fā)現(xiàn)，βcatenin siRNA明顯下調(diào)MMP-2蛋白，并激活促凋亡蛋白Bad和Bax的表達(dá)。見圖5。

3 討 論

吡格列酮是一種人工合成的高選擇性PPARγ激動(dòng)劑，臨床上常用于治療Ⅱ型糖尿病，上市以來經(jīng)過幾年的臨床使用尚未發(fā)現(xiàn)有明顯的副作用。近年來研究表明，吡格列酮具有抗腫瘤的功效，能抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［3-5］，但是吡格列酮對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的研究鮮有報(bào)道。

圖3 A.TUNEL實(shí)驗(yàn)表明吡格列酮誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡;B.吡格列酮抑制凋亡相關(guān)蛋白Bad、Bax表達(dá)

圖4 隨著吡格列酮濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，β-catenin蛋白表達(dá)水平逐漸下調(diào)

圖5 β-catenin siRNA下調(diào)U251細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Bad、Bax蛋白表達(dá)

腫瘤發(fā)生最突出的特征是細(xì)胞異常增殖，因此本研究首先采用CCK-8法觀察了吡格列酮對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨藥物濃度和作用時(shí)間的增加細(xì)胞活力逐漸降低，呈藥物濃度-時(shí)間負(fù)性依賴方式。膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中主要以局部浸潤為主，腫瘤細(xì)胞從腫瘤中心向周邊正常腦組織侵襲，無包膜形成，造成手術(shù)界限不清，腫瘤組織無法完全切除，導(dǎo)致殘留腫瘤組織在顱內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)是治療失敗及腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素。遷移能力增強(qiáng)是腫瘤細(xì)胞侵襲的一個(gè)主要步驟;在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲過程中，蛋白酶對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(extacrellularmairix，ECM)的降解是另一個(gè)關(guān)鍵步驟。其中以基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproeteinases，MMPs)最為重要，幾乎能降解ECM和基底膜的所有成分，在ECM降解過程中起主導(dǎo)作用［6］。MMP-2是MMPs中一種重要的蛋白酶，與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性密切相關(guān)［7-8］。本研究通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，吡格列酮能抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的遷移能力;Western Blot法檢測(cè)顯示，吡格列酮能顯著降低MMP-2的蛋白表達(dá)，提示吡格列酮能增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的黏附性，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。

研究顯示，呈侵襲性的細(xì)胞可通過表達(dá)某些凋亡調(diào)節(jié)基因抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。凋亡途徑障礙在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤生物治療的重要方向。通過TUNEL熒光染色，本研究發(fā)現(xiàn)吡格列酮在抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的同時(shí)還促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白中，Bad和Bax蛋白是關(guān)鍵性凋亡誘導(dǎo)因子。我們的研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可以上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Bad和Bax蛋白表達(dá)水平。

β-catenin是連環(huán)蛋白家族中的一員，它既是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)重要組成部分，同時(shí)又是重要的細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞骨架成分［9］。目前，β-catenin被公認(rèn)為是一種原癌基因［10］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吡格列酮能夠顯著降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中β-catenin的蛋白水平。特異性敲除β-catenin后膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MMP-2表達(dá)下調(diào)，而Bad和Bax蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。因此，我們認(rèn)為吡格列酮的抗膠質(zhì)瘤作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)βcatenin的表達(dá)介導(dǎo)的。吡格列酮通過抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)破壞其對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制膠質(zhì)瘤的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)研究證明，吡格列酮通過β-catenin介導(dǎo)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，且通過下調(diào)MMP-2的表達(dá)降低細(xì)胞的侵襲能力，上調(diào)Bad和Bax水平來誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果提示吡格列酮對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有抗腫瘤的功效，有望作為膠質(zhì)瘤新的治療藥物，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

［1］張建超，楊天明.磁性納米鐵治療大鼠膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2010，29(3):254-259.

［2］HOUSEKNECHT K L，COLE B M，STEELE P J.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPARgamma)and its ligands:a review［J］.Domest Anim Endocrinol，2002，22(1):1-23.

［3］KOGA H，SELVENDIRAN K，SIVAKUMAR R，et al.PPARγ potentiates anticancer effects of gemcitabine on human pancreatic cancer cells［J］.Int J Oncol，2012，40(3):679-685.

［4］FU H，ZHANG J，PAN J，et al.Chemoprevention of lung carcinogenesis by the combination of aerosolized budesonide and oral pioglitazone in A/Jmice［J］.Mol Carcinog，2011，50(12):913-921.

［5］郭晏同，冷希圣，趙景明，等.過氧化物酶體增殖物激活受體γ配體對(duì)誘導(dǎo)大鼠肝癌的抑制作用［J］.中華肝臟病雜志，2005，13(2):145-146.

［6］CURRAN S，MURRAY GI.Martix metalloporoteinase in tumor invasion and metastis［J］.J Pathol，1999，189(3):300-308.

［7］RAO JS，STECK P A，MOHANAM S，et al.Elevated levels of M(r)92，000 type IV collagenase in human brain tumors［J］.Cancer Res，1993，53:2208-2211.

［8］FORSYTH P A，WONG H，LAING T D，et al.Gelatinase-A(MMP-2)，gelatinase-B(MMP-9)and membrane type matrix metalloproteinase-1(MT1-MMP)are involved in different aspects of the pathophysiology of malignant gliomas［J］.Br J Cancer，1999，79:1828-3185.

［9］BUCHMAN J J，DURAK O，TSAI L H.ASPM regulatis Wnt signaling pathway activity in the develpoing brain［J］.Genes Dev，2011，25(18):1909-1914.

［10］LIM SC，LEE M S.Significance of E-cadherin/beta-catenin complex and cyclinD1 in breast cancer［J］.Oncol Rep，2002，9(5):915-928.