腸道病毒71型特異性單克隆抗體的制備及其在病毒鑒定中的應(yīng)用

吳菲菲，董敏，葛路遙，胡馨云，張程，張建華，江炳福，孟繼鴻

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210009)

腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是引起嬰幼兒手足口病(hand foot and mouth disease，HFMD)的主要病原體之一，主要感染5歲以下嬰幼兒，其典型臨床癥狀為發(fā)熱和手、足、口腔等部位皮疹或皰疹，少數(shù)可出現(xiàn)無(wú)菌性腦膜炎、腦炎和心肌炎等嚴(yán)重并發(fā)癥，個(gè)別重癥患兒病情惡化甚至死亡［1-3］。根據(jù)2009～2012年衛(wèi)生部公布的傳染病疫情報(bào)告顯示，我國(guó)HFMD的發(fā)病人數(shù)一直高居報(bào)告?zhèn)魅静〉氖孜?，疫情逐年上升。近年?lái)，HFMD流行在東南亞地區(qū)也有上升趨勢(shì)，且EV71和柯薩奇病毒A16(CA16)交替出現(xiàn)［4-7］。嵇紅等人報(bào)道了2008年至2010年江蘇省HFMD流行病學(xué)研究結(jié)果，認(rèn)為輕癥病例以EV71和CA16共同主導(dǎo)流行，而重癥病例和死亡病例則以EV71感染為主［8］。EV71感染引起的HFMD在臨床癥狀和體征方面與CA16等其它腸道病毒所致的手足口病較難區(qū)別，因此需要特異的病原學(xué)診斷幫助鑒別。此外，EV71 HFMD的預(yù)防和控制需要依靠疫苗，因此從臨床標(biāo)本中分離、培養(yǎng)和鑒定EV71病毒株用于疫苗株的篩選十分重要。本課題擬制備EV71的特異性單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上嘗試建立EV71特異性檢測(cè)的免疫熒光技術(shù)，用于病毒分離培養(yǎng)后的EV71鑒定，為EV71 HFMD的診斷和疫苗株的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒毒株

本實(shí)驗(yàn)室以往分離鑒定的腸道病毒毒株EV71-NJ05-2010(基因序列號(hào) JQ409487)、CA16-MAS04-2010(基因序列號(hào)JQ409496)和Echo6-NJ01-2010(基因序列號(hào)JQ409486)［9］于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 單抗的制備

采用常規(guī)方法，以EV71 VP1為免疫原免疫6～8周齡雌性Balb/c小鼠，末次免疫后3 d無(wú)菌操作取其免疫脾細(xì)胞，在PEG4000作用下與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0以10∶1的比例融合，加入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，用含20%胎牛血清的HAT培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中選擇培養(yǎng)，用間接ELISA方法篩選。

1.3 單抗的ELISA鑒定

分別用4種代表性腸道病毒VP1蛋白(EV71 HIS-VP1、EV71 GST-VP1、CA16 HIS-VP1 和 Echo6 HIS-VP1)包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜，PBST洗2遍后加入雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，經(jīng)37℃孵育40 min、PBST洗5遍后加入1∶10 000 HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體，再經(jīng)37℃孵育40 min、PBST洗5遍后加入底物TMB顯色，采用酶標(biāo)儀測(cè)定A450值。

1.4 標(biāo)本采集與病毒分離

HFMD患兒的咽拭子標(biāo)本104份，由南京市兒童醫(yī)院、馬鞍山市疾病預(yù)防與控制中心和長(zhǎng)春市兒童醫(yī)院提供。按照《手足口病預(yù)防控制指南(2009版)》中樣品采集及檢測(cè)技術(shù)方案的要求進(jìn)行預(yù)處理，接種非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)，置于36℃、5%CO2培養(yǎng)箱連續(xù)培養(yǎng)7 d，盲傳3代，若出現(xiàn)人腸道病毒特征性的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，則將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 分離病毒的免疫熒光鑒定

將已接種病毒的長(zhǎng)成單層的Vero細(xì)胞傾去維持液，PBS洗3次后用-20℃預(yù)冷的甲醇置于-20℃固定5 min，PBS洗3次后每孔加5%FBSPBS100μl，封閉2 h，吸干，每孔滴加單抗50μl，37℃濕盒中作用1 h，PBS洗3次后每孔加入一定稀釋度的FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG，37℃濕盒中避光作用1 h，PBS洗3次后吸干，鏡檢，拍照。

1.6 病毒RNA提取及RT-PCR鑒定

參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行，具體方法如下:取病毒分離上清100 μl，用 QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)提取病毒 RNA，操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用OneStep RT-PCR Kit(QIAGEN)進(jìn)行擴(kuò)增，腸道病毒通用引物(Fa、Rb)和 EV71特異性引物(F1、R1)，見(jiàn)表1。一步法RT-PCR的反應(yīng)體系為20μl，包括:RNA 5 μl，5 × RT-PCR Buffer 4 μl，dNTP Mix(10 mmol·L-1)0.8 μl，Enzyme Mix 0.8 μl，上下游引物(10 pmol·μl-1)各 0.5 μl，水(RNase-free)8.4 μl。一步法 RTPCR的擴(kuò)增條件為:42℃逆轉(zhuǎn)錄45 min;95℃預(yù)變性15 min;95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，50個(gè)循環(huán);72℃末次延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

表1 RT-PCR擴(kuò)增用引物及其序列Tab 1 Primers for PT-PCR amplification and their sequence

2 結(jié) 果

2.1 單克隆抗體的制備與鑒定

共獲得2株穩(wěn)定分泌McAbs的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3E12和5C1。用ELISA檢測(cè)，這2株單抗均可與EV71 HIS-VP1和EV71 GST-VP1蛋白反應(yīng)，都不與Echo6 HIS-VP1蛋白反應(yīng);3E12不與CA16 HIS-VP1蛋白反應(yīng)，而5C1則與CA16 HIS-VP1蛋白反應(yīng)(表2)。結(jié)果表明3E12為 EV71特異性單抗，5C1為EV71和CA16的共同性單抗。

表2 抗EV71 HIS-VP1單抗與4種不同蛋白的免疫反應(yīng)結(jié)果Tab 2 Immune reaction results of 3E12 and 5C1 with four kinds proteins

2.2 EV71特異性單抗免疫熒光檢測(cè)方法的建立

將制備獲得的單抗3E12和5C1與用3種腸道病毒代表株EV71-NJ05-2010、CA16-MAS04-2010和Echo6-NJ01-2010感染的Vero細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)(圖1)，結(jié)果3E12只與EV71感染的細(xì)胞反應(yīng)，與CA16和Echo6感染的細(xì)胞不反應(yīng);而5C1與EV71、CA16感染的細(xì)胞反應(yīng)，與Echo6感染的細(xì)胞不反應(yīng)。由此可見(jiàn)，EV71特異性單抗3E12免疫熒光檢測(cè)腸道病毒具有較好的EV71特異性，可以進(jìn)一步用于EV71的鑒定。

圖1 EV71 HIS-VP1單抗與EV71、CA16和Echo6感染細(xì)胞的免疫熒光反應(yīng)性Fig 1 Immune reaction results of EV71 HIS-VP1 with cells carrying EV71，CA16 and Echo6

2.3 HFMD臨床標(biāo)本的病毒分離培養(yǎng)

將104份來(lái)自不同地區(qū)的臨床HFMD患者標(biāo)本接種Vero細(xì)胞，其中有35份分離到病毒，產(chǎn)生腸道病毒典型的CPE，如圖2。

圖2 HFMD標(biāo)本接種Vero細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞病變Fig 2 Cytopathic effect of Vero cells inoculated by HFMD samples

2.4 分離病毒的免疫熒光鑒定

用EV71特異性單抗3E12免疫熒光檢測(cè)從臨床標(biāo)本分離的35份毒株，其中29份免疫熒光檢測(cè)為陽(yáng)性(EV71)，6份免疫熒光檢測(cè)為陰性(非 EV71)，EV71陽(yáng)性率為82.9%。圖3顯示了部分分離株的免疫熒光陽(yáng)性與陰性的檢測(cè)結(jié)果。其中標(biāo)本1、2、3、4和6免疫熒光檢測(cè)鑒定為EV71，標(biāo)本5免疫熒光檢測(cè)鑒定為非EV71。

2.5 分離病毒的RT-PCR驗(yàn)證

將從臨床標(biāo)本中分離到的35份毒株抽提病毒RNA，采用EV和EV71單管二重一步法RT-PCR進(jìn)行病毒驗(yàn)證(圖4)。35株病毒分離物均能擴(kuò)增出大小為306 bp的產(chǎn)物，屬于腸道病毒。其中29份均可擴(kuò)增出大小為889 bp的EV71特異性引物擴(kuò)增條帶，鑒定為EV71;6份無(wú)EV71特異性引物擴(kuò)增條帶，為非EV71腸道病毒。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與免疫熒光結(jié)果完全一致。

3 討 論

HFMD是常見(jiàn)的出疹性疾病，主要感染兒童。近年來(lái)，HFMD在東南亞地區(qū)疫情嚴(yán)重，反復(fù)暴發(fā)流行。我國(guó)自2008年在安徽阜陽(yáng)市暴發(fā)HFMD以來(lái)，該病在我國(guó)一直呈高流行態(tài)勢(shì)。HFMD可由多種腸道病毒引起，EV71是最主要的病原體。自1969年EV71首次分離確認(rèn)以來(lái)［11］，EV71已在全球范圍內(nèi)引起多次暴發(fā)和流行。劉鳳仁等報(bào)道了近4年深圳市HFMD流行病學(xué)研究結(jié)果，認(rèn)為EV71是引起HFMD的主要病原體。同時(shí)也有報(bào)道顯示，HFMD重癥病例主要由EV71感染引起。汪照國(guó)等［12］報(bào)道2008～2009年青島市HFMD流行病學(xué)和病原學(xué)研究結(jié)果，EV71感染引起的HFMD輕癥和重癥的比率均高于CA16?？婅髌嫉龋?3］報(bào)道2010～2011年浙江省HFMD病原學(xué)特征分析，研究發(fā)現(xiàn)重癥病例和死亡病例中EV71核酸陽(yáng)性的比例分別為85.53%和96.08%。EV71感染引起的HFMD易引發(fā)并發(fā)癥，從臨床標(biāo)本中分離、培養(yǎng)、鑒定EV71以進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性，對(duì)EV71 HFMD的診斷和預(yù)防控制具有重要意義。

本研究中我們以EV71 VP1為免疫原制備單抗，共獲得2株穩(wěn)定分泌的單抗3E12和5C1。2株單抗經(jīng)ELISA和免疫熒光鑒定，3E12為EV71特異性單抗，5C1為EV71和CA16共同性單抗。以特異性單抗3E12建立的特異性檢測(cè)EV71的免疫熒光方法鑒定從不同地區(qū)HFMD患者標(biāo)本中分離的35份病毒株，29份鑒定為EV71，陽(yáng)性率為82.9%，6份為非EV71的其他腸道病毒。鑒定結(jié)果與RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果完全一致，表明以特異性單抗3E12建立的免疫熒光方法敏感性高、特異性強(qiáng)。

圖3 單抗3E12免疫熒光鑒定從臨床標(biāo)本分離的EV71毒株Fig 3 EV71 viruses which were tested by immunofluorescence from clinic samples

圖4 EV和EV71單管二重一步法RT-PCR鑒定臨床標(biāo)本分離毒株Fig 4 Separated clinic viruses(EV and EV71)identified by RT-PCR

本研究中我們先將標(biāo)本接種細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，再利用免疫熒光鑒定分離培養(yǎng)出的病毒。病毒分離培養(yǎng)雖然耗時(shí)，對(duì)于臨床標(biāo)本的診斷應(yīng)用有一定的局限性，但最終可以獲得特定的病毒，對(duì)于疾病的診斷來(lái)說(shuō)有最直接的證據(jù)，對(duì)于確定診斷意義重大，該方法更有利于進(jìn)一步開(kāi)展病原學(xué)的研究，特別是對(duì)疫苗研制提供了眾多的候選株。目前RT-PCR常用于對(duì)病毒標(biāo)本的檢測(cè)和鑒定，雖然高度敏感和特異，PCR產(chǎn)物還可以用于基因測(cè)序，進(jìn)一步開(kāi)展序列分析，但RTPCR技術(shù)要求高、操作復(fù)雜，且容易污染。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR采用單管閉合及特異性標(biāo)記的探針來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增后不打開(kāi)管蓋直接通過(guò)管內(nèi)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量，在檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)靈敏度上均有了明顯的提高，但由于儀器的購(gòu)置費(fèi)用較高，較難在基層單位中推廣?？傊?，無(wú)論何種PCR技術(shù)最終均不能獲得活的病毒，無(wú)法替代傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)。本研究通過(guò)制備EV71特異性單克隆抗體，建立特異性免疫熒光方法對(duì)從HFMD臨床標(biāo)本中分離培養(yǎng)的病毒進(jìn)行EV71鑒定，獲得了大量的EV71病毒株，為下一步開(kāi)展EV71滅活疫苗和減毒活疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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