基于酶抑制的電化學(xué)生物傳感器快速檢測茶葉中的對氧磷

劉淑娟，鐘興剛，李彥

（1.湖南省農(nóng)科院茶葉研究所，湖南 長沙 410125；2.湖南省茶葉檢測中心，湖南 長沙 410125）

茶是我國傳統(tǒng)的經(jīng)濟作物和出口創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品。隨著人們生活水平的提高，茶葉的質(zhì)量衛(wèi)生狀況越來越受到人們的重視。傳統(tǒng)的茶葉農(nóng)藥殘留檢測一般是采用氣相色譜儀、質(zhì)譜儀等儀器對干茶農(nóng)殘進行檢測，需要昂貴的儀器設(shè)備，并且樣品的前處理過程繁瑣、檢測時間較長?；趯Σ枞~農(nóng)藥殘留監(jiān)管效率的更高要求，茶葉農(nóng)殘快速檢測新技術(shù)的開發(fā)日益受到重視。

基于酶抑制的電化學(xué)傳感技術(shù)是目前農(nóng)殘快速檢測研究最為活躍的領(lǐng)域。膽堿酯酶（ChE）在與有機磷類物質(zhì)結(jié)合后，生物催化活性受到抑制，這一原理可用于有機磷生物傳感器的構(gòu)建。利用此原理構(gòu)造的有機磷生物傳感器具有簡單、快速、靈敏、低成本和便于攜帶等優(yōu)點[1-3]。國內(nèi)外關(guān)于利用膽堿酯酶和有機磷水解酶檢測有機磷的文獻已有報道[4-8]，但將這種技術(shù)用于茶葉有機磷快速檢測的報道極少。

本實驗在金電極表面電沉積一層ZrO2納米粒子以固定乙酰膽堿酯酶，制成膽堿酯酶/ZrO2粒子層/金電極（AChE/ZrO2/Au）電流型生物傳感器，用于測定茶葉中的對氧磷。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

金電極和CHI760b電化學(xué)工作站購于中國上海辰華儀器廠；電化學(xué)反應(yīng)池為三電極系統(tǒng)，其中膽堿酯酶修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極；乙酰膽堿酯酶（500 U/mg）、氯化乙酰巰基膽堿購于Sigma公司；對氧磷購于國家農(nóng)藥質(zhì)檢中心（沈陽）；電化學(xué)測量的支持電解質(zhì)為0.067 mol/L的磷酸緩沖溶液（PBS），由KH2PO4和Na2HPO4配置而成；其他試劑均為分析純，所用水為二次蒸餾水。

1.2 傳感器的制備

金電極在使用前分別用0.3 μm和0.05 μm的鋁粉拋光至鏡面，依次在6 M HNO3、丙酮和二次蒸餾水中各超聲清洗2 min，水洗并用氮氣吹干。實驗開始前，把清洗過的金電極置于0.2 M的硫酸溶液中，在0.5～1.5 V的電位范圍內(nèi)采用循環(huán)伏安法掃描至穩(wěn)定后，用去離子水洗滌并用氮氣吹干。將以上處理好的金電極放入5.0 mM 的ZrOCl2·8H2O和0.1 M KCl的混合溶液中，在－1.1～＋0.7 V之間以20 mV/s的速度掃描十個循環(huán)，通過電化學(xué)掃描實現(xiàn)ZrO2納米粒子在金電極表面的電沉積，掃描完成后取出電極水洗并氮氣吹干。將傳感器表面朝上，用微量進樣器移取10 μL乙酰膽堿酯酶溶液滴加到二氧化鋯電沉積層表面，室溫靜置2 h，即制得AChE/ZrO2/Au電極有機磷生物傳感器。

1.3 檢測方法

采用計時電流法檢測對氧磷。在含2 mmol/L氯化乙酰巰基膽堿的PBS（pH 7.5）緩沖液中測定傳感器的原始響應(yīng)電流（測定電壓為0.45 V）。然后將傳感器置于對氧磷溶液中浸泡20 min，在相同條件下檢測傳感器在底物中的響應(yīng)電流，根據(jù)計時電流的減小程度計算樣品溶液中對氧磷的濃度。

1.4 傳感器的再生

將傳感器放入濃度為5.0 mmol/L的2-PAM 溶液輕度攪拌5 min，即可洗脫有機磷，再生酶的活性。再生后的傳感器經(jīng)清洗后即可用于下一次檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳感器工作原理

在金電極表面電沉積二氧化鋯納米粒子以固定乙酰膽堿酯酶，二氧化鋯納米粒子用于有機磷傳感器的構(gòu)造，可使傳感器獲得較大的比表面積，有利于增加酶的吸附量并保持生物分子（酶）的催化活性，提高傳感器的響應(yīng)性能。

抑制型酶電化學(xué)傳感器的構(gòu)建原理是依據(jù)乙酰膽堿酯酶催化活性的改變。傳感器工作時，底物氯化乙酰巰基膽堿在乙酰膽堿酯酶催化下分解成巰基膽堿和有機酸，而有機磷農(nóng)藥的磷酰基與乙酰膽堿酯酶的活性中心絲氨酸羥基反應(yīng)，生成共價結(jié)合的磷?；?，使酶的活性降低，因而底物氯化乙酰巰基膽堿水解反應(yīng)被抑制，生成的反應(yīng)產(chǎn)物減少。實驗通過電化學(xué)方法檢測底物氯化硫代乙酰膽堿的水解電流，按下列公式可計算有機磷對乙酰膽堿酯酶的百分抑制率[9]：

式中：A指乙酰膽堿酯酶的百分抑制率，I0指未被有機磷抑制的酶電極的響應(yīng)電流，I指被有機磷抑制后的酶電極的響應(yīng)電流。圖2顯示了電極在吸附有機磷前和被有機磷抑制活性后在底物中的循環(huán)伏安圖。從圖中可看出，被有機磷抑制后傳感器的氧化峰和還原峰（c）都明顯低于抑制前的氧化峰和還原峰（b）。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

實驗依據(jù)底物氯化乙酰巰基膽堿濃度對緩沖液的pH值進行了選擇。結(jié)果表明，pH 7.5的PBS磷酸緩沖溶液能較好地保持乙酰膽堿酯酶的活性，且傳感器響應(yīng)電流較大。底物氯化乙酰巰基膽堿濃度為2.0 mmol/L時，傳感器的電化學(xué)響應(yīng)最佳。

實驗對甲基對硫磷的最佳抑制時間進行了考察。結(jié)果表明，乙酰膽堿酯酶的相對活性隨著有機磷抑制時間的增加相應(yīng)降低。當(dāng)抑制時間小于20 min時，乙酰膽堿酯酶的相對活性隨時間增加降低明顯；抑制時間大于20 min后，酶的相對活性不再隨抑制時間的增加有顯著變化。故實驗選擇有機磷對乙酰膽堿酯酶的抑制時間為20 min。

實驗還考察了乙酰膽堿酯酶的濃度對傳感器的響應(yīng)特性的影響。根據(jù)在其他條件相同的情況下得到的響應(yīng)電流可知，酶的活性濃度與傳感器的響應(yīng)靈敏度呈反比；但是，酶濃度過低，傳感器響應(yīng)電流強度減小，傳感器的檢測線性范圍會變窄。實驗選擇乙酰膽堿酯酶的最佳濃度為50 mU/mL，既能使傳感器保持較高的靈敏度，又能獲得較寬的檢測線性范圍。

圖2 不同修飾的金電極在PBS在底物巰基膽堿中的循環(huán)伏安圖

2.3 傳感器的電流響應(yīng)

AChE/ZrO2/Au有機磷傳感器被對氧磷抑制后，在底物中的計時電流降低。對氧磷的濃度越大，對電化學(xué)信號的抑制作用越明顯，傳感器在底物氯化乙酰巰基膽堿溶液中的響應(yīng)電流越小。圖3是對氧磷濃度與膽堿酯酶抑制率的負對數(shù)曲線圖，由圖可知，抑制率與甲基對硫磷濃度在5.0×10-7～5.5×10-4g/L范圍內(nèi)成線性關(guān)系，最低檢出限為1.0×10-7g/L。

2.4 傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

將制好的對硫磷傳感器在相同條件下對對氧磷溶液（濃度為1.0×10-6g/L）重復(fù)測定10次，測得乙酰膽堿酯酶抑制率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.26%；將同批次制備的5支對氧磷傳感器在相同條件下測定，檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.82%，結(jié)果表明，用本方法制作的酶電極，置于pH 7.5的磷酸緩沖液中于4℃冰箱中保存，放置20 d后仍可維持較好的活性。

圖3 對氧磷濃度對乙酰膽堿酯酶百分抑制率的校正曲線

2.5 傳感器的再生

傳感器在完成一次對氧磷檢測后，采用1.4所述的方法對傳感器進行再生。酶電極連續(xù)檢測和再生使用6次后活性仍達到最初活性的90%以上（圖4）。

圖4 傳感器再生能力實驗

2.6 非特異性試驗

實驗考察了有機磷傳感器在磷酸根離子、硫酸根離子及硝酸根離子等無機離子存在下對響應(yīng)電流的影響。結(jié)果表明，在這類離子存在下，傳感器電流響應(yīng)無明顯變化。實驗還對傳感器在氯氰菊酯、三氯殺螨醇等菊酯類和有機氯類農(nóng)藥存在時的響應(yīng)電流進行了考察。結(jié)果表明，在這類農(nóng)藥殘留存在時，傳感器的響應(yīng)電流亦無明顯變化。

2.7 回收率實驗

實驗考察了傳感器在6個不同待測茶湯樣品添加對氧磷溶液后的回收率。先按照農(nóng)藥的正確使用方法配置一定濃度的對氧磷溶液噴施多個茶葉樣品，放置過夜，將茶葉剪碎后浸入丙酮溶液中震蕩，過濾后定容至10 mL的容量瓶中。用本文提出的方法檢測樣品溶液中對氧磷的濃度。然后在各樣品中加入已知量的對氧磷溶液，再以同樣方法對添加后的樣品進行測定，得到的平均回收率在96.05%至105.47%之間，表明試驗結(jié)果較為準(zhǔn)確。

表1 添加回收率試驗

2.8 與傳統(tǒng)分析方法的比較

為了考察實際應(yīng)用的可能性，實驗用酶傳感器檢測5個不同對氧濃度的茶葉樣品，并將檢測結(jié)果與氣相色譜法得到的結(jié)果進行比較，兩種方法的測定結(jié)果基本相符（表2）。

表2 用傳感器法和高效氣相色譜法分別測得的茶湯樣品中對氧磷的濃度

3 結(jié)論

茶葉有機磷農(nóng)殘含量水平直接影響人體健康，也越來越被廣大消費者所關(guān)注。本文構(gòu)建的AChE/ZrO2/Au有機磷傳感器可直接檢測液相中的對氧磷。傳感器構(gòu)造簡單，茶葉經(jīng)簡單浸提即可直接用于檢測。傳感器對目標(biāo)物對氧磷的檢出限低，線性范圍寬、靈敏度高、重現(xiàn)性好，而且電極使用壽命較長，操作簡便。進一步肯定了該方法在茶葉有機磷檢測中的應(yīng)用效果，可作為茶葉有機磷殘留傳統(tǒng)檢測方法的有力補充。

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