真空氣流細胞破壁技術對桑葉中有效成分提取的影響

孫長波，石磊嶺，涂建飛，韓丹丹，張清清，張 晶,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學發(fā)展學院，吉林 長春 130600；3.新疆中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

桑葉為?？?Moraceae)植物桑(Morus alba L.)的干燥葉子，藥用歷史悠久，具有廣泛的藥理活性，是中醫(yī)清熱解毒之要藥，用于風熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭疼、目赤暈花等癥[1]。桑葉中多糖、黃酮及生物堿均可不同程度的降低糖尿病小鼠的血糖，促進其肝糖元的合成，增加肝糖元含量[2-6]，增加糖尿病動物糖的貯藏能力，同時對其并發(fā)的血脂異常有一定的改善作用[7]。1-脫氧野尻霉素(DNJ)是桑葉中所特有的，且含量極高的生物堿類成分，黃酮類成分——蘆丁的含量在桑葉中也很高，它們均為天然的α-糖苷酶抑制劑[8-11]，可作為治療糖尿病、病毒感染、腫瘤轉移及溶酶體儲存紊亂等眾多疾病的藥物。自桑葉中提取降糖有效成分是現(xiàn)在的一個研究熱點。

真空氣流植物細胞破壁(vacuum air current for plant cell wall breakdown，VAPB)技術現(xiàn)主要應用于將果蔬干燥，并制成非油炸脆片。其原理是：將新鮮植物樣品在密閉加壓條件下進行加熱，使細胞內水份急速汽化而使胞內壓力迅速升高，然后對其進行瞬間減壓，細胞壁因壓力巨變而破碎，得到細胞破壁植物樣品。保持破壁溫度至樣品干燥完全。此技術對植物細胞破壁率高，可達90%以上，且不改變藥材的外觀，溫度可根據(jù)植物樣品所含成分的性質進行控制。由于細胞壁的破碎，使內部的有效成分更易被溶劑溶出，可大大提高有效成分的提取量。但此項技術在中藥成分提取的前處理過程中的應用報道較少[12-13]。本實驗就此技術對桑葉中有效成分提取率的影響進行研究，將桑葉中多糖、生物堿、黃酮3類成分最大量的提取，可提高桑葉的藥效，利于其應用開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

桑葉：真空氣流細胞破壁與未破壁桑葉樣品均由吉林省品品源生物科技有限公司提供，均為?？浦参锷?Morus alba L.)的干燥葉，采集于2011年5月山東。桑葉經(jīng)真空氣流細胞破壁處理，電鏡檢測破壁率大于90%，即為破壁桑葉。分別粉碎，過60目篩，待用。

1.2 試劑與儀器

LC-2010高效液相色譜儀(SPD-10Avp紫外檢測器；LC-Solution色譜工作站)、UV-1700分光光度計 日本島津公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

蘆丁標準品(批號0080-9750，純度≥98%) 中國食品藥品檢定研究院；葡萄糖標準品(批號20110514，純度≥98%) 中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；DNJ標準品(批號WKQ0117，純度≥98%) 四川維克奇生物科技有限公司；芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl，純度≥98%) 上海共價化學有限公司；甘氨酸(純度≥99%) 上海邁瑞爾化學技術有限公司；甲醇、乙腈(均為色譜純) 美國Fisher公司；純凈水 杭州娃哈哈集團；其余試劑及藥品均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 HPLC法測定桑葉中DNJ含量

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm)；流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫：0～30min為30%～60%A；檢測波長：254nm；柱溫：25℃；流速：1.0mL/min；進樣量：20μL。

1.3.1.2 DNJ對照品溶液制備精密取DNJ標準品2.0mg，以甲醇定容至20mL，得0.1mg/mL的DNJ標準原溶液，從中分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL溶液，甲醇定容至1mL，得質量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的DNJ標準溶液，過膜，備用。

1.3.1.3 樣品溶液制備

取破壁和未破壁的桑葉各5.000g，分別用80%的乙醇溶液超聲提取3次，30min/次，合并提取液，濃縮至干，用甲醇分別定容到10mL，得破壁和未破壁的桑葉樣品原液。

1.3.1.4 柱前衍生化法測定DNJ的含量

分別取DNJ系列質量濃度標準溶液、破壁及未破壁樣品原液各10μL于1mL容量瓶中，各加10μL硼酸鹽緩沖液(pH8.5)及10mmol/L Fmoc-Cl乙腈溶液20μL，混勻后于20℃水浴反應20min，再加入10μL 0.2mol/L的甘氨酸，使過量衍生化試劑反應，以水定容至1mL，混勻后過0.45μm的微孔濾膜，得質量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/mL的DNJ的標準溶液和待測樣品溶液。按1.3.1.1節(jié)進行DNJ峰面積值的測定，由線性方程求出樣品液中DNJ的質量濃度。

1.3.1.5 標準曲線、線性范圍和方法學考察

精密吸取衍生化的對照品溶液各20μL，進樣，測定峰面積，以DNJ質量濃度(X)為橫坐標，DNJ的峰面積(Y)為縱坐標，線性回歸，得到回歸方程：Y=3447430000X＋ 120459.6，R2=0.9992。線性范圍為0.2～1.0μg/mL。取0.2μg/mL的衍生化對照品溶液，稀釋成一系列的溶液，進行分析，確定DNJ檢出限為0.02μg/mL(RSN= 3)。

精密度實驗：取1.0μg/mL的DNJ對照品衍生溶液20μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。

穩(wěn)定性實驗：精密稱取未破壁桑葉粉，按1.3.1.3、1.3.1.4節(jié)制成衍生化供試品溶液，于制備后0、1、2、4、6、8h進行測定。

重復性實驗：精密稱取2.500g未破壁桑葉粉6份，按1.3.1.3、1.3.1.4節(jié)分別制成供試品溶液，測定樣品中DNJ含量。

加樣回收率實驗：精密稱取6份已知DNJ含量的未破壁桑葉粉各1.000g，分別加入0.1mg/mL的DNJ溶液2mL，按1.3.1.3和1.3.1.4節(jié)分別制成供試品溶液，測定其中DNJ含量。

1.3.2 HPLC法測定桑葉中蘆丁含量

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil ODS2(4.6mm×250mm，5μm)；流動相為甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫：0～10min為40%～50%A，10～15min時50%～55%A；檢測波長：358nm；柱溫：25℃；流速：1.0mL/min；進樣量：20μL。

1.3.2.2 蘆丁對照品溶液制備

精確稱取蘆丁標準品5.0mg，以甲醇定容至50mL，搖勻，配制成0.1mg/mL的蘆丁標準溶液。從中分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，以甲醇定容至1mL，配成質量濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的蘆丁對照品溶液，過膜，備用。

1.3.2.3 樣品溶液的制備

取1.3.1.3節(jié)制備的破壁與未破壁樣品原液各2mL，以甲醇定容至10mL的容量瓶中，供測定蘆丁含量用。

1.3.2.4 標準曲線、線性范圍和方法學考察

精密吸取蘆丁的對照品溶液各20μL，進樣，測定峰面積，以蘆丁質量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，線性回歸，得到回歸方程：Y=27184495X＋ 20465.1，R2=0.9999。線性范圍為0.0～0.1mg/mL。取0.02mg/mL的對照品溶液，稀釋成系列溶液，進行分析，得蘆丁檢出限為0.002mg/mL(RSN= 3)。

精密度實驗：取0.02mg/mL的蘆丁對照品溶液20μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。

穩(wěn)定性實驗：精密稱取1.000g破壁桑葉粉6份，按1.3.1.3節(jié)制成供試品溶液分別于0、1、2、4、6、8h進行測定。

重復性實驗：精密稱取1.000g未破壁桑葉粉6份，分別制成供試品溶液，測定樣品中蘆丁含量。

加樣回收率實驗：精密稱取6份已知蘆丁含量的未破壁桑葉粉各1.000g，分別加入1mg/mL的蘆丁溶液1mL制成供試品溶液，測定其中蘆丁含量。

1.3.2.5 樣品中蘆丁含量的測定

將1.3.1.3節(jié)制備的破壁及未破壁桑葉溶液20μL按照1.3.2.1節(jié)條件測定蘆丁峰面積，由線性方程求出樣品液中蘆丁的含量。

1.3.3 分光光度法測定桑葉中多糖含量

1.3.3.1 葡萄糖對照品溶液的制備

精密稱取105℃干燥至恒質量的葡萄糖對照品25.0mg于25mL的容量瓶，加水溶解至刻度，得1mg/mL的葡萄糖標準貯備液。分別取葡萄糖標準貯備液0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mL于10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，得質量濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32mg/mL的葡萄糖系列對照品溶液。過膜，備用。

1.3.3.2 硫酸-蒽酮法測定桑葉中多糖含量[14]

精密吸取葡萄糖系列對照溶液及蒸餾水各1.0mL，分別置于10mL具塞試管中，冰水浴5min，加入0.2%蒽酮硫酸試液4mL搖勻，立即置于沸水浴加熱15min，取出，冷水冷卻至室溫，室溫放置10min左右，于620nm波長處測定吸收度。以葡萄糖質量濃度(ρ)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性方程：A=1.151ρ＋0.3714，R2=0.9994。線性范圍為0.02～0.32mg/mL。

1.3.3.3 樣品溶液的制備

取破壁和未破壁的桑葉各5.000g，分別置于索氏提取裝置中，用石油醚(60～90℃)回流2h，再用95%乙醇回流2h，進行脫脂處理。殘渣揮干溶劑，加水50mL，40℃超聲提取3次，30min/次，合并提取液，用Sevag法(氯仿-正丁醇體積比4:1)去除蛋白，6000r/min離心20min，取上清液濃縮至5mL，加無水乙醇使乙醇含量達80%以上，靜置12h，抽濾，得沉淀物，用乙醇和丙酮各洗脫3次，于60℃干燥得白色無定形粉末。將其以水定容于100mL容量瓶中，供多糖含量測定。

1.3.3.4 樣品中多糖含量的測定

取1.3.1.3節(jié)制備的破壁及未破壁溶液各1mL，按照1.3.3.2節(jié)方法進行樣品溶液的吸光度的測定，通過回歸方程計算出多糖的質量濃度。

2 結果與分析

2.1 DNJ的HPLC測定結果

參照文獻[15-17]方法，對DNJ進行柱前衍生化，有效的去除了雜質，并在HPLC測定條件上進行了改善，采用乙腈-水梯度洗脫，DNJ衍生化產(chǎn)物的保留時間在18.7min左右，其他衍生化試劑吸收峰的保留時間大于29min，所得峰形對稱，分離度高，干擾小，且避免了酸對色譜柱的損傷。色譜圖見圖1。

圖 1 DNJ含量測定的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of DNJ

DNJ精密度實驗，其保留時間的相對標準偏差(RSD)為0.37%(n = 6)，峰面積的RSD為1.32%(n = 6)，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性實驗，DNJ峰面積的RSD為0.52%(n = 6)，說明樣品液在8h內基本穩(wěn)定；重復性實驗的RSD為1.98% (n = 6)，說明方法可行；加樣回收率實驗，加樣回收率為98.76%，RSD為2.11%(n = 6)。經(jīng)方法學考察，結果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

2.2 蘆丁的HPLC測定結果

蘆丁為酸性成分，采用HPLC法測定其含量時，流動相中常加入酸，以防止拖尾現(xiàn)象的產(chǎn)生[18-20]。本實驗所建立的測定條件中，避免了酸的使用，且由圖2可知，經(jīng)方法學考察及樣品中蘆丁含量檢測的應用，色譜峰分離度高，峰面積值穩(wěn)定。

精密度實驗，保留時間的RSD值為0.87%，峰面積的RSD 為1.59%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性實驗，蘆丁峰面積RSD值為1.12%(n = 6)，說明樣品液在8h內基本穩(wěn)定；重復性實驗，RSD為1.41%(n = 6)，說明方法可行；加樣回收率實驗，加樣回收率為99.07%，RSD為1.45%(n = 6)。

2.3 破壁與未破壁桑葉比較結果

由表1可知，經(jīng)真空氣流植物細胞破壁技術(VAPB)處理的桑葉，其DNJ、蘆丁及多糖含量測定值均明顯高于未進行破壁處理樣品。破壁處理對多糖的測定值影響最小，為未破壁處理樣品值的1.48倍；對DNJ及黃酮的影響則分別為1.74倍和1.58倍。

表 1 破壁與未破壁桑葉中DNJ、蘆丁及多糖的測定含量(n=3)Table 1 Contents of DNJ, rutin and polysaccharose in mulberry leaf samples (n=3)mg/g

3 結 論

通過比較VAPB處理前后的桑葉樣品中DNJ、蘆丁及多糖含量的測定值可知，VAPB在桑葉有效成分提取過程中發(fā)揮了極大的作用，破壁較未破壁桑葉樣品中的生物堿、黃酮及多糖含量的測定值分別高出74%、58%和48%，使有效成分溶出量顯著提高，可使其藥理活性得到更充分的發(fā)揮。將VAPB技術應用于其他植物中成分的提取具有極大的推廣潛力。

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