乙烯利對1-MCP處理南果梨冷藏后香氣及香氣合成過程中關(guān)鍵酶活的影響

張麗萍，紀淑娟*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110161)

南果梨為秋子梨系(Pyrus ussriensis Maxim.)的一種，是遼寧省的特色水果。南果梨采收時果實色綠、肉脆質(zhì)硬、汁少味甜、無香氣。適度后熟后，果色金黃艷麗、帶紅暈，香氣誘人，肉質(zhì)細膩，汁液豐富，酸甜適口，品質(zhì)極佳，深受消費者青睞[1]。1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)是目前最有效的乙烯受體抑制劑，可特異性地阻斷乙烯與其受體的正常結(jié)合，從而有效阻止內(nèi)源乙烯的合成和外源乙烯的誘導(dǎo)作用，降低呼吸躍變型果實的呼吸強度和乙烯釋放速率，進而延長果實的貯藏壽命[2-3]。1-MCP作為一種后熟抑制劑，應(yīng)用在南果梨上，可有效延長南果梨的常溫貨架期，提高冷藏南果梨的保鮮效果[4]，但是董萍等的研究結(jié)果表明，1-MCP處理減少了南果梨香氣成分種類，對酯類物質(zhì)影響也較大[5]。乙烯是植物體內(nèi)重要的內(nèi)源植物生長調(diào)節(jié)劑，它參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，特別是在躍變型果實成熟衰老過程中發(fā)揮著重要的作用，被認為是果實成熟衰老的啟動因子[6-7]。Palou等[8]和Zhou等[9]分別研究了外源乙烯對低溫貯藏油桃和桃果實的部分生理作用，Zhang Lihua等[10]研究表明，乙烯利處理可以顯著增加果實的呼吸強度、可溶性固形物和總酚含量，但關(guān)于外源乙烯對1-MCP處理的南果梨冷藏后果實風(fēng)味物質(zhì)合成的具體調(diào)控作用及調(diào)控途徑過程中關(guān)鍵酶活性的影響未見報道。本實驗旨在通過研究冷藏對果實香氣及香氣合成關(guān)鍵酶活性的影響，揭示外源乙烯與南果梨果實揮發(fā)性芳香風(fēng)味物質(zhì)之間的調(diào)控機制。建立提高冷藏南果梨果實揮發(fā)性芳香風(fēng)味物質(zhì)的外源乙烯喚醒技術(shù)最佳參數(shù)，解決南果梨果實貯藏香氣品質(zhì)降低的問題。

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

試驗所用南果梨果實于2011年9月23日采自遼寧省鞍山市大孤山鎮(zhèn)，當(dāng)天運回沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室進行分級處理，挑選大小、成熟度相對一致，果質(zhì)量大小均勻一致，無病蟲害、機械損傷果實作試材。于采收當(dāng)天用0.75μL/L的1-MCP保鮮劑處理24h，處理方法參見參考文獻[11]，1-MCP處理的果實裝入內(nèi)襯0.02mm PE膜的塑料箱內(nèi)，在常溫(20±2)℃條件下放置7d后轉(zhuǎn)入冷庫，于(0±0.5)℃貯藏。1-MCP南果梨在冷藏5個月時轉(zhuǎn)出冷庫，轉(zhuǎn)出當(dāng)天分別用2、4、6、8mmol/L的乙烯利溶液進行浸泡處理2min，對照果實用蒸餾水浸泡處理2min，處理后在室溫條件下放置待測，每7d測一次數(shù)據(jù)。

1.2 試劑與儀器

1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP) 美國羅門哈斯公司；曲拉通、乙二胺四乙酸(EDTA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、亞油酸鈉、二硫蘇糖醇(DTT)、聚烯吡咯烷酮(PVP)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、輔酶焦磷酸硫胺素(TPP)、還原型輔酶(NADH)、丙酮酸、苯甲基磺酰氟(PMSF)、二硝基苯甲酸(DTNB)、羥乙基哌嗪乙硫磺酸 上海源葉生物有限公司；乙酰輔酶A、乙醇脫氫酶 美國Sigma公司。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Finnigan公司；TU 1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 南果梨香氣的測定

氣相色譜條件：HP-Innowax色譜柱(30m×250μm，0.25μm)；程序升溫：40℃保留2min，然后以4℃/min升至60℃保留1min，再以2℃/min升至150℃，再以10℃/min升至210℃保留5min。傳輸線溫度為250℃。載氣為He，流速1mL/min，不分流。

質(zhì)譜條件：連接桿溫度280℃，電離方式為電子電離(electron ionization，EI)，離子源溫度200℃，掃描范圍45～600u。

數(shù)據(jù)處理：通過檢索NIST/Wiley標準譜庫，進行定性分析，并用峰面積歸一法測算各化學(xué)成分的相對含量。

1.4 酶活性的測定

1.4.1 脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)活性測定

參照陳昆松等[12]的方法，取2g果肉置于研缽內(nèi)，冰浴研磨，加入10mL經(jīng)4℃預(yù)冷50mmol/L(pH7.0)的磷酸緩沖液，混勻充分浸提后，12000r/min(4℃)離心30min，取上清液。在3mL反應(yīng)體系中含亞油酸鈉母液25μL、0.1mol/L(pH6.0)的檸檬酸-磷酸緩沖液2.775mL、粗酶液0.2mL，反應(yīng)溫度30℃，于234nm波長處測定LOX活性，加酶液后15s開始計時，記錄1min內(nèi)OD值的變化，結(jié)果以比活性表示(U/mg)。

1.4.2 醇脫氫酶活性(alcoholdehydrogenase，ADH)測定

參照田長平等[13]的方法，取3g果肉置于研缽內(nèi)，液氮充分研磨呈粉末狀，加入經(jīng)4℃預(yù)冷的提取液，混勻充分浸提后，15000r/min(4℃)離心30min，取上清液。在3mL反應(yīng)體系中加入2.4mL MES-Tris緩沖液、1.6mmol/L的NADH 0.15mL、80mmol/L乙醛0.15mL、0.3mL粗酶液，反應(yīng)溫度30℃，于340nm波長處測定ADH活性，加酶液后15s開始計時，記錄1min內(nèi)OD值的變化。

1.4.3 氫過氧化物裂解酶(hydrogen peroxide repressible enzyme，HPL)活性測定

參照Salas等[14]的方法，取3g果肉冷凍組織置于研缽內(nèi)，液氮充分研磨呈粉狀，加入6mL經(jīng)4℃預(yù)冷的提取液，混勻充分浸提后，14000r/min(4℃)離心30min，取上清液。在3.5mL反應(yīng)體系中含2mL緩沖液、0.75mL反應(yīng)底物液、0.15mL 1.6mmol/L的NADH、0.1mL ADH酶液、0.5mL粗酶液，反應(yīng)溫度30℃，于340nm波長處測定OD值，加酶液后15s開始計時，記錄1min內(nèi)OD值的變化。

1.4.4 醇?；D(zhuǎn)移酶(alcohol acyltransferase，AAT)活性測定

參照Echever ia等[15]的方法，取3g果肉置于研缽內(nèi)，液氮充分研磨，加入2.25mL蛋白提取液，冰浴提取20min，12000r/min(4℃)離心20min，取其上清液。將反應(yīng)液：2.5mL 5mmol/L MgCl2溶液、150μL乙酰輔酶A溶液、50μL丁醇溶液、150μL酶提取液混合后放置35℃水浴15min，然后添加100μL 0.01mol/L的DTNB，室溫下放置10min，412nm波長處比色，用不含酶提取液的反應(yīng)液做空白。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003 軟件和SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 對主要酯類物質(zhì)含量的影響

表 1 不同濃度乙烯利處理對1-MCP處理的南果梨冷藏后貨架期間酯類物質(zhì)含量的影響Fig.1 Effect of different concentrations of ethephon on ester content of 1-MCP treated Nanguo pear during shelf life after refrigerated storage

果實的香氣是由多種揮發(fā)性物質(zhì)形成的，其中，酯類物質(zhì)是果實呈香的主要物質(zhì)。由表1可以看出，南果梨中的酯類香氣成分主要有乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、乙酸庚酯、庚酸乙酯和苯乙酸乙酯。與對照果實相比，2mmol/L外源乙烯處理的乙酸庚酯和庚酸乙酯的相對含量都低于對照組，而2mmol/L外源乙烯處理的乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯和苯乙酸乙酯的相對含量均明顯高于對照和其他幾種處理。與對照果實相比，2mmol/L外源乙烯處理的南果梨酯類香氣有極好的顯著影響(P＜0.01)。

2.2 對脂氧合酶活性的影響

脂氧合酶(LOX)途徑是次生物質(zhì)代謝的一個重要途徑，許多研究都表明LOX途徑及其產(chǎn)物參與了乙烯的生物合成，并與果實的成熟衰老密切相關(guān)[16-18]。由圖1可以看出，在1-MCP處理的南果梨冷藏后轉(zhuǎn)入常溫貨架期間，對照和不同濃度乙烯利處理的南果梨的LOX活性均呈先上升后下降的趨勢。在貨架期的前14d，LOX活性隨后熟時間的延長而上升，至14d時LOX活性達到高峰，之后LOX活性隨貨架時間的延長而下降。在14d時2mmol/L乙烯利處理的果實LOX活性高達45mU/mg，而對照、4、6、8mmol/L乙烯利處理LOX活性分別為30、32、37、21mU/mg。2mmol/L和6mmol/L乙烯利處理的LOX活性始終高于對照，其中以2mmol/L乙烯利處理的果實LOX活性極顯著高于對照(P＜0.01)，而6mmol/L乙烯利處理的果實LOX活性也顯著高于對照(P＜0.05)。

圖 1 不同濃度乙烯利對1-MCP處理的南果梨冷藏后常溫貨架期間脂氧合酶活性的影響Fig.1 Effect of different concentrations of ethephon on LOX activity of 1-MCP treated Nanguo pear during shelf-life after refrigerated storage

2.3 對醇脫氫酶活性的影響

圖 2 不同濃度乙烯利對1-MCP處理的南果梨冷藏后常溫貨架期間醇脫氫酶活性的影響Fig.2 Effect of different concentrations of ethephon on ADH acitivity of 1-MCP treated Nanguo pear during shelf-life after cold storage

醇脫氫酶(ADH)催化醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇，從而為酯類物質(zhì)的合成提供代謝前體。Manríquez等[19]從甜瓜果實中克隆出的Cm-ADH1與Cm-ADH2兩個ADH基因，研究表明，ADH對果實香氣形成具有重要的作用。由圖2可以看出，對照和不同濃度乙烯利處理的ADH活性隨著果實的不斷成熟呈先下降后上升的趨勢，2、4、6、8mmol/L乙烯利處理與對照 LOX 活性無顯著差異(P＞0.05)。由此可見，不同濃度的乙烯利對ADH活性的影響作用不明顯。

2.4 對氫過氧化物裂解酶活性的影響

氫過氧化物裂解酶(HPL)是合成香氣途徑的另一個重要酶，經(jīng)過HPL作用過氧羥基脂肪酸裂解為醛類和含氧酸。由于底物的不同HPL的作用位點也分為3種：9位裂解酶、13位裂解酶和無特異位置裂解酶，而且HPL的底物特異性直接決定了植物揮發(fā)性物質(zhì)的組成[20]。由圖3可知，冷藏南果梨果實轉(zhuǎn)入常溫后熟過程中HPL的酶活性先逐漸增加，然后又有所下降。2mmol/L乙烯利處理的HPL活性顯著高于對照和其他濃度乙烯利處理(P＜0.05)。

圖 3 不同濃度乙烯利對1-MCP處理的南果梨冷藏后常溫貨架期間氫過氧化物裂解酶活性的影響Fig.3 Effect of different concentrations of ethephon on HPL activity of 1-MCP treated Nanguo pear during shelf-life after cold storage

2.5 對醇酰基轉(zhuǎn)移酶活性的影響

圖 4 不同濃度乙烯利對1-MCP處理的南果梨冷藏后常溫貨架期間醇?；D(zhuǎn)移酶活性的影響Fig.4 Effect of different concentrations of ethephon on AAT activity of 1-MCP treated Nanguo pear during shelf-life after cold storage

醇酰基轉(zhuǎn)移酶(AAT)在酯類化合物的生物合成過程中起關(guān)鍵作用[21]，在AAT作用下，醇類底物可以與?；?CoA 中的?；セ癁轷?。AAT是酯類合成途徑中最末端的關(guān)鍵酶，在酯類合成中扮演了重要的角色，也是催化酯類化合物生物合成的關(guān)鍵酶之一。由圖4可以看出，在南果梨果實的采后成熟和后熟過程中，AAT活性呈先升高后降低的變化趨勢，這與大多數(shù)酯類化合物相對含量的變化趨勢吻合。對照和不同濃度乙烯利處理的南果梨AAT活性都在貨架14d時出現(xiàn)高峰，其中2mmol/L乙烯利處理的AAT活性極顯著高于其他4個處理的酶活性(P＜0.01)。

3 結(jié) 論

LOX、HPL、ADH和AAT是脂肪酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，同時也是酯類物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶，探討1-MCP處理的南果梨冷藏后關(guān)鍵酶活性的變化對研究不同濃度乙烯利處理后果實香氣物質(zhì)的機理具有重要價值。有研究表明，乙烯利處理可以顯著增加果實的呼吸強度、可溶性固形物和總酚含量[15]，但并沒有對果實酯類物質(zhì)以及脂肪酸代謝途徑的關(guān)鍵酶的相關(guān)研究。本研究結(jié)果表明：1-MCP處理的南果梨冷藏后經(jīng)過不同濃度乙烯利處理，對照、4、6、8mmol/L這4種處理的脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵酶LOX、HPL和AAT活性均顯著低于2mmol/L乙烯利處理的酶活性，而不同濃度乙烯利處理與對照處理ADH酶活性無顯著差異，這說明低濃度的乙烯利處理能夠提高南果梨脂肪酸途徑中LOX、HPL和AAT的酶活性。2mmol/L和6mmol/L乙烯利處理的南果梨酯類物質(zhì)的相對含量顯著高于對照、4mmol/L和8mmol/L這幾種處理，這說明2mmol/L和6mmol/L乙烯利處理能夠提高南果梨酯類物質(zhì)的相對含量，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明2mmol/L乙烯利處理有較高的顯著性。由此可知，經(jīng)1-MCP處理的南果梨冷藏后用2mmol/L乙烯利進行復(fù)醒處理可有效提高LOX、HPL和AAT活性，從而提高果實的酯類物質(zhì)含量，使果實表現(xiàn)出濃郁的香氣。這些關(guān)鍵酶活性的下降是酯類物質(zhì)合成減慢的主要原因，而酶活性下降可能與1-MCP熏蒸處理抑制了果實內(nèi)源乙烯的產(chǎn)生有關(guān)，也可能與乙烯信號傳導(dǎo)過程有關(guān)，有待進一步研究。

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