南海不同產(chǎn)地近江牡蠣中?；撬岷繖z測(cè)

高加龍，章超樺,*，邱偉佳，曹文紅，秦小明

(1.水產(chǎn)品深加工廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；3.國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東 湛江 524088)

牛磺酸(二氨基乙磺酸)是一種游離氨基酸，廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中，含量達(dá)毫摩爾濃度[1]。其在貝類、軟體動(dòng)物和甲殼類等海洋生物中含量尤其多，如馬氏珠母貝中?；撬岷?.2%(干基)[2]，新鮮牡蠣每千克含8g左右[3]。

牛磺酸的檢測(cè)方法報(bào)道較多，有酸堿滴定法、薄層色譜法、氨基酸分析儀法和高效液相色譜法[4-7]等，目前最常用的是高效液相色譜法。高效液相色譜法是利用?；撬崤c衍生試劑反應(yīng)的衍生物在紫外燈下的特征吸收來檢測(cè)，分為柱前衍生和柱后衍生，常用的衍生劑有鄰苯二甲醛(OPA)[7-8]、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)[9]、異硫氰酸苯酯(PITC)[10]、4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜惡二唑(NBD-F)[11]和9-氯甲酸芴甲酯(FMOC)等[12-13]。國標(biāo)GB/T 5009.169—2003《食品中?；撬岬臏y(cè)定》采用OPA柱前衍生法[14]，但OPA柱前衍生產(chǎn)生的衍生物質(zhì)不穩(wěn)定，衍生1.5min響應(yīng)值達(dá)到峰值，其后逐步下降，而且衍生物質(zhì)在反應(yīng)終止1min后消減37%以上，操作中必須嚴(yán)格控制衍生時(shí)間和進(jìn)樣時(shí)間[7]。國標(biāo)GB 5413.26—2010《嬰幼兒食品和乳品中的牛磺酸檢測(cè)》中規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中?；撬釞z測(cè)采用OPA柱后衍生法和丹磺酰氯柱前衍生法[15]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)牡蠣樣品檢測(cè)?；撬岬那疤幚矸椒ㄟM(jìn)行探討，對(duì)OPA柱后衍生和丹磺酰氯柱前衍生兩種方法進(jìn)行優(yōu)化，建立適合牡蠣樣品?；撬釞z測(cè)的方法，并測(cè)定了南海不同產(chǎn)地牡蠣中?；撬岬暮俊?/p>

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

近江牡蠣(Ostrea rivularis)，2011年4月采集于汕頭、汕尾、深圳、臺(tái)山、陽江、湛江、北海、欽州牡蠣養(yǎng)殖場(chǎng)，清洗瀝干后－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

?；撬針?biāo)準(zhǔn)品(純度＞97%) 日本關(guān)東化學(xué)試劑株式會(huì)社；鄰苯二甲醛(OPA，分析純)；2-巰基乙醇(分析純)；丹磺酰氯(色譜純)；甲醇(色譜純)；乙腈(色譜純)；聚氧乙烯月桂酸醚(Brij-35)、鹽酸甲胺、亞鐵氰化鉀、偏磷酸、乙酸鈉、冰乙酸、磷酸二氫鉀、硼酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀(配備RF-10AXL熒光檢測(cè)器、SPD-20A紫外檢測(cè)器) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

沉淀劑Ⅰ：稱取15.0g亞鐵氰化鉀，用水溶解并定容至100mL。該沉淀劑在室溫下3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。

沉淀劑Ⅱ：稱取30.0g乙酸鋅，用水溶解并定容至100mL。該沉淀劑在室溫下3個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定。

檸檬酸緩沖液：稱取19.6g檸檬酸三鈉，加950mL水溶解，加入1mL苯酚，用硝酸調(diào)pH值至3.10～3.25，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾；乙酸鈉緩沖液(pH4.2)(10mmol/L)：稱取0.820g乙酸鈉，加800mL水溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.2，用水定容至1000mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾；鄰苯二甲醛衍生溶液：稱取0.60g鄰苯二甲醛，用10mL甲醇溶解后，加入0.5mL 2-巰基乙醇和0.35g Brij-35，用0.5mol/L的硼酸鉀溶液定容至1000mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。臨用前配制；丹磺酰氯溶液(1.5mg/mL)：稱取0.15g丹磺酰氯，用乙腈溶解并定容至100mL，臨使用前配制；鹽酸甲胺溶液(20mg/mL)：稱取2.0g鹽酸甲胺，用水溶解并定容至100mL，該溶液在4℃條件下3個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定；?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1mg/mL)：稱取0.1000g?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至100mL，儲(chǔ)備液在4℃條件下可保存7d。

1.3.2 樣品前處理

將凍藏的湛江牡蠣樣品自然解凍后勻漿破碎，采用下列不同的前處理方法對(duì)該樣品勻漿液進(jìn)行處理。

1)超聲波處理[15]：精密稱取1.000g已勻漿的牡蠣樣品于100mL容量瓶中，加水約70mL，超聲提取約15min，冷卻，用水定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾；2)偏磷酸溶液處理[7]：準(zhǔn)確稱取已勻漿的牡蠣10g，用10mg/mL的偏磷酸溶液溶解，并定容至100mL。充分搖勻后經(jīng)超聲波振蕩5min，取60mL經(jīng)振蕩的樣液在4000r/min條件下離心15min。準(zhǔn)確吸取1mL上清液用蒸餾水定容至100mL，用0.22μm微孔濾膜過濾，丟棄前1mL濾液后，接取2mL供衍生反應(yīng)用；3)沉淀劑處理[15]：稱取已勻漿的牡蠣5g，于100mL容量瓶中，加入80mL溫水(50～60℃)溶解，充分混勻，置超聲波振蕩器上振蕩10min，冷卻到室溫。加1.0mL沉淀劑Ⅰ，渦旋混合，1.0mL沉淀劑Ⅱ，渦旋混合，用水定容至刻度，充分混勻，試液于5000r/min離心10min，取上清液濾膜過濾備用；4)三氯乙酸(TCA)處理[16]：準(zhǔn)確稱取已勻漿樣品5g，加蒸餾水20mL，沸水浴15min，加15% TCA處理，定容至100mL，5000r/min離心15min(4℃)，取上清液濾膜過濾備用；5)熱水煮處理[17]：取5g已勻漿樣品，加70mL水，100℃熱水浴15min，濾去殘?jiān)?000r/min離心20min后，取上清液濾膜過濾備用。

1.3.3 色譜條件

表 1 色譜條件Table 1 Chromatographic conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 OPA柱后衍生法

衍生物的衍生效果對(duì)OPA柱后衍生測(cè)定牛磺酸至關(guān)重要，影響衍生效果的主要因素是衍生劑的流速和衍生反應(yīng)溫度。固定衍生劑流速0.3mL/min，改變衍生反應(yīng)溫度，記錄不同溫度下衍生物的峰面積(圖1)。從圖1可以看出，反應(yīng)溫度在50℃時(shí)衍生物的峰面積最大，因此選用此溫度為衍生反應(yīng)溫度。在衍生反應(yīng)溫度50℃條件下，改變衍生劑的流速，研究不同流速對(duì)衍生物峰面積的影響(圖2)，從圖2可見，隨著衍生劑流速增大峰面積逐漸增大，在0.3mL/min時(shí)達(dá)到峰值，隨后又呈下降趨勢(shì)，因此衍生劑流速選用0.3mL/min。

圖 1 反應(yīng)溫度與峰面積的關(guān)系Fig.1 Relationship between temperature and peak area at a flow rate of 0.3 mL/min

圖 2 衍生試劑流速與峰面積的關(guān)系Fig.2 Relationship between flow rate and peak area at 50 ℃ for reaction temperature

2.1.2 丹磺酰氯柱前衍生法

2.1.2.1 流動(dòng)相配比對(duì)保留時(shí)間和峰面積的影響

流動(dòng)相配比對(duì)樣品的保留時(shí)間、峰面積和分離效果均有影響，表2為不同流動(dòng)相配比下牛磺酸的保留時(shí)間和峰面積。隨著乙腈比例逐漸增大，樣品出峰時(shí)間縮短，峰面積逐漸增大，當(dāng)乙腈-10mmol/L乙酸鈉緩沖液(30：70，V/V)時(shí)峰面積最大，此時(shí)樣品分離情況良好，因此選用此流動(dòng)相為丹磺酰氯柱前衍生的流動(dòng)相。

表 2 流動(dòng)相配比對(duì)保留時(shí)間和峰面積的影響Table 2 Effect of mobile phase composition on the retention time and peak area of taurine

2.1.2.2 衍生反應(yīng)時(shí)間

圖3為不同衍生反應(yīng)時(shí)間下?；撬崤c丹磺酰氯柱前衍生產(chǎn)物的峰面積，反應(yīng)1h時(shí)峰面積最大。將樣液衍生后從0h(立即進(jìn)樣)到50h不同時(shí)間段進(jìn)樣，檢測(cè)峰面積見圖4，從圖4可見，在30h前衍生物峰面積一致，在48h后只減弱了4.4%，在48h內(nèi)峰面積變異系數(shù)RSD為1.96%。因此，樣液須避光衍生1h，衍生后可避光保存48h。

圖 3 衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)峰面積的影響Fig.3 Relationship between reaction time and peak area

圖 4 衍生物不同時(shí)間進(jìn)樣的峰面積Fig.4 Peak areas of derivatives obtained after reaction for different periods of time

2.2 色譜分離

圖 5 ?；撬針?biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of standard taurine

采用上述色譜條件，?；撬針?biāo)準(zhǔn)品在兩種色譜方法下牛磺酸均得到良好洗脫和分離(圖5)，用OPA柱后衍生法，?；撬針?biāo)準(zhǔn)品在氨基酸柱上保留時(shí)間6.9min(圖5A)，而丹磺酰氯柱前衍生法，在C18柱上保留時(shí)間3.3min(圖5B)。從色譜圖上可以看出，0.6μg/L質(zhì)量濃度的牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)液丹磺酰氯柱前衍生比0.6μg/mL質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液OPA柱后衍生響應(yīng)值高，說明丹磺酰氯柱前衍生法靈敏度更高一些。

2.3 線性關(guān)系和靈敏度

將?；撬針?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)液，按照兩種色譜方法衍生測(cè)定，以峰面積A對(duì)質(zhì)量濃度C分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以空白樣品產(chǎn)生信號(hào)(峰高)為基線噪音，將標(biāo)準(zhǔn)液多倍稀釋后進(jìn)樣，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)液濃度產(chǎn)生信號(hào)為基線噪音3倍，即信噪比(RSN)為3的標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度定義為檢出限。兩種色譜法的回歸方程和檢出限見表3。由表3可見，在各自線性范圍內(nèi)，兩種色譜方法的線性關(guān)系良好。丹磺酰氯柱前衍生法檢出限比OPA柱后衍生法低3個(gè)數(shù)量級(jí)，靈敏度更高一些。

表 3 線性相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Correlation coefficients and limit of detection

2.4 方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性

精密度是指多次測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性，精密度常以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來量度。隨機(jī)抽取一個(gè)樣品溶液重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果見表4，OPA柱后衍生法RSD為0.81%，丹磺酰氯柱前衍生法RSD為6.42%，表明OPA柱后衍生法的精密度好于丹磺酰氯法，這是由于丹磺酰氯柱前衍生法靈敏度更高的緣故。

表 4 精密度實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 4 Result of accuracy analysis (n=6)

分別稱取牡蠣樣品6份，超聲波處理后，用上述優(yōu)化的色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表5，兩種方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.31%和0.56%，說明兩種方法具有較好的重復(fù)性。

表 5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)(n=6)Table 5 Repeatability of the methods (n=6)

將標(biāo)準(zhǔn)液與樣液交叉進(jìn)樣6次，記錄保留時(shí)間，檢驗(yàn)方法的穩(wěn)定性，OPA柱后衍生法平均保留時(shí)間3.337min，RSD為0.22%，丹磺酰氯柱前衍生法平均保留時(shí)間6.932min，RSD為0.02%，說明兩種方法均具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 前處理方法

同一牡蠣樣品，分別用5種不同的前處理方法提取后用上述OPA柱后衍生法測(cè)定，每種方法平行提取3次，結(jié)果取平均值(圖6)，從圖6可見，超聲波處理15min牛磺酸的提取量最高。?；撬崾且杂坞x形式存在于牡蠣組織中，絕大部分存在于細(xì)胞內(nèi)，因此要細(xì)胞破壁才能使?；撬釘U(kuò)散出來。TCA、沉淀劑、偏磷酸等化學(xué)方法和熱水浸提、超聲波處理等物理方法綜合對(duì)比來看，牡蠣中超聲波提取方法較好。

圖 6 不同處理方式對(duì)牡蠣中?；撬崽崛〉挠绊慒ig.6 Effects of different pre-treatment methods on extraction efficiency

2.6 方法加標(biāo)回收率

精密稱取已知含量的牡蠣樣品，加入不同量的?；撬針?biāo)準(zhǔn)液，超聲波處理15min提取，提取液用兩種色譜法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算回收率，結(jié)果見表6。超聲波處理-OPA柱后衍生測(cè)定方法的回收率為92.14%～96.73%，超聲波處理-丹磺酰氯柱前衍生測(cè)定方法的回收率為92.24%～96.73%。

表 6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)Table 6 Spike recoveries of the methods

2.7 樣品測(cè)定

將湛江、欽州、北海、陽江、汕頭、汕尾、深圳和臺(tái)山8個(gè)南海海域的牡蠣樣品分別進(jìn)行超聲處理，處理后的樣品采用上述兩種色譜方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果換算為干基見表7(以干基計(jì))。兩種方法的測(cè)定結(jié)果無顯著性差異(P＞0.05)，說明兩種方法均適合于牡蠣樣品中的?；撬釞z測(cè)。這8個(gè)牡蠣產(chǎn)地中南海東北部海域(汕頭、汕尾、深圳、臺(tái)山)的牡蠣?；撬岷肯鄬?duì)較低(12.55～13.82mg/g，干基)，而西南海域(湛江、欽州、北海、陽江)的牡蠣牛磺酸含量較高(16.81～19.83mg/g，干基)，但與文獻(xiàn)[3]報(bào)道新鮮牡蠣每千克含?；撬岷?g左右還有很大差異。造成含量差異的原因可能是牡蠣苗種不同，本次樣品的采集地汕頭、汕尾、深圳、臺(tái)山牡蠣養(yǎng)殖場(chǎng)的牡蠣苗種出自珠海，而湛江、欽州、北海、陽江幾家養(yǎng)殖場(chǎng)育苗來自欽州。此外牡蠣等貝類自身不能合成牛磺酸，只能對(duì)?；撬崞鸬叫罘e作用[3]，因此與所在海域水質(zhì)以及牡蠣的養(yǎng)殖時(shí)間也有很大關(guān)系。

表 7 牡蠣樣品中?；撬岷縏able 7 Determination of taurine in Ostrea rivularis by the methods mg/g

3 結(jié) 論

牡蠣樣品經(jīng)超聲波處理后采用OPA柱后衍生高效液相色譜法和丹磺酰氯柱前衍生色譜法均可得到滿意的結(jié)果。OPA柱后衍生法操作簡(jiǎn)便，方法精密度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性均可達(dá)到測(cè)量要求，但此法需要氨基酸陽離子色譜柱，此類色譜柱價(jià)格較貴，另需配備柱后衍生系統(tǒng)。丹磺酰氯柱前衍生法在普通C18柱上即可分離，樣品需先避光衍生處理，衍生物在48h內(nèi)穩(wěn)定，可以滿足一般檢測(cè)需要，但由于?；撬崤c丹磺酰氯衍生試劑產(chǎn)生的衍生物質(zhì)響應(yīng)值較高，方法靈敏度高，所以?；撬岷枯^高的樣品需多倍稀釋才可進(jìn)樣，從而影響方法的精密度。

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