高效液相色譜法測定紫色疣石磺中的膽甾醇

孫變娜 沈和定 吳洪喜 姚理想 程知慶 王冬鳳

(1.上海海洋大學省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室 上海 201306;2.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所 浙江溫州 325005;3.浙江省近岸水域生物資源開發(fā)與保護重點試驗室 浙江溫州 325005)

紫色疣石磺Peronia verruculata隸屬軟體動物門(Mollusca),腹足綱(Gastropoda),肺螺亞綱(有肺類Pulmonata),縮眼目(Systellommatophora),石磺科(Onchidiidae);其身體柔軟無貝殼,軀體背后部有樹枝狀鰓[1]。紫色疣石磺多見于我國福建、廣東、海南、香港等地沿海潮間帶的中下部灘涂,越南、泰國等東南亞國家沿海也有分布,資源豐富。石磺產(chǎn)品已在江蘇鹽城(俗稱海癩子)、浙江溫州(俗稱涂龜)、福建寧德(俗稱土鮑)等地形成廣泛的市場,民間流傳石磺有治哮喘、治療風濕病、滋補、助消化、消除疲勞、明目等功效。冰糖燉石磺據(jù)說對治療哮喘有特效,并常被作為產(chǎn)后孕婦良好的滋補品;沿海居民食用石磺的歷史悠久[2]。在中國海洋藥物辭典中有如下記載:石磺別名土海參,四季捕撈,捕后洗凈,除去內(nèi)臟,取肉鮮用;肉入藥;有滋補強壯之功效;主治肝硬化、久病體虛等癥狀[3]。近幾年國內(nèi)石磺產(chǎn)品供不應求,已從越南等國大量進口。國內(nèi)外對石磺的研究主要集中在系統(tǒng)分類[1,4,5-7]、生物學特性[8-10]、受精機制[11]、繁殖[12-14]、胚胎發(fā)育[15-16]、神經(jīng)系統(tǒng)[17]、線粒體基因組全序列分析[18]、營養(yǎng)價值[19-20]等,目前,紫色疣石磺中膽甾醇的測定尚未見報道。膽甾醇的測定方法主要有吸光光度法、氣相色譜法與高效液相色譜法等。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展,高效液相色譜法因其樣品預處理簡單,方法準確度、精確度及靈敏度較高,在測定生物組織中膽甾醇含量的應用中日益廣泛[21-23]。本實驗擬建立高效液相色譜法(HPLC)測定紫色疣石磺中的膽甾醇含量,能為膽甾醇分析方法的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

動物材料于2012年11月采集自廣東湛江,經(jīng)上海海洋大學沈和定教授鑒定為紫色疣石磺(Peronia verruculata),憑證標本(No.12DZ-1) 超低溫(-80℃)保存在上海海洋大學海洋貝類實驗室。取紫色疣石磺解剖并去除內(nèi)臟,用液氮研磨成粉末。膽甾醇標準品:Sigma公司(C8667);甲醇為色譜純(Fisher公司),其他藥品、試劑均為國產(chǎn)分析純。

日立L-2130高效液相色譜儀,日立L-2130型泵系統(tǒng),日立L-2450紫外檢測器;電熱恒溫水浴;KQ-50B舒美超聲波清洗器;AUY120型電子分析天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

精密稱取膽甾醇對照品約51mg,置于50mL量瓶中,加適量甲醇超聲溶解,用甲醇定容至刻度,搖勻,即得1.02mg/mL的對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備

準確稱取紫色疣石磺粗粉10.0g,置于250mL具塞錐形瓶中,加三氯甲烷:甲醇(2:1)混合液125mL,超聲提取3次,每次20min,用快速濾紙過濾,濾紙及殘渣用混合液洗滌數(shù)次,收集濾液和洗液,置于250mL具塞圓底燒瓶中,加入無水乙醇25mL,500g/L氫氧化鉀溶液6mL,在60～65℃水浴皂化45min,皂化時不斷振搖;皂化完畢后,稍冷后加入25mL 50g/L氯化鈉溶液,混勻后加入37.5mL乙醚萃取3次,將乙醚溶液置于250mL分液漏斗中,加少量水多次洗滌提取液(至洗滌液為中性),提取液用無水硫酸鈉脫水,水浴揮干溶劑,用甲醇定容至100mL,混勻,即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件

色譜柱:COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ,(4.6mm×250mm,5μm);流動相:甲醇;流速1.0mL/min;進樣量:20μL;柱溫:35℃。紫外檢測器波長:204nm。

1.3 定量測定

標準曲線:精密吸取膽甾醇對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分別置于2mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻。采用外標定量。樣品中的膽甾醇含量根據(jù)標準曲線方程進行計算。

1.4 回收率測定

在同一樣品中加入一定量的膽甾醇標準品,制備供試品溶液,進樣測定,以考察方法的準確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 膽甾醇標準曲線繪制

根據(jù)不同質(zhì)量濃度膽甾醇標準溶液的出峰面積,以膽甾醇質(zhì)量濃度X(mg/mL)為橫坐標,峰面積Y為縱坐標,繪制標準曲線圖(見圖1)。膽甾醇標準品色譜圖如圖2所示。

由圖1可知,膽甾醇在0.102～0.510mg/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度的線性回歸方程為,Y=44186105X-331118相關(guān)系數(shù)R2為0.9998,表明膽甾醇在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。由圖2可知,膽甾醇的保留時間為13min,出峰較快,為快速檢測奠定了基礎。

2.2 回收率測定

取已知含量的紫色疣石磺粗粉約5g,共5份,精密稱定,分別加入不同濃度膽甾醇對照品,“1.2.2”項方法制備供試品溶液,分別測定,利用差減法求出膽甾醇的回收率(見表1)。結(jié)果表明,此方法的平均回收率為98.53%,相對標準偏差RSD=1.72%。

2.3 精密度測定

同一樣品重復進樣6次,所測峰面積平均值為43517511.33±156546.4,RSD為0.36%。結(jié)果表明精密度良好。

2.4 樣品的測定

取3批樣品,按“1.2.2”項方法制備供試品溶液,按上述色譜條件進行含量測定峰面積并計算含量。3批樣品中膽甾醇含量見表2。由結(jié)果知,高效液相色譜法測得該紫色疣石磺樣品中膽甾醇的平均質(zhì)量濃度為50.37μg/mL,換算到原料中膽甾醇的平均質(zhì)量濃度為503.7mg/kg。

3 結(jié)語

膽甾醇是維持人體正常新陳代謝不可缺少的原料,是抗老防衰、延年益壽的重要物質(zhì)之一。它不僅是構(gòu)成細胞膜的重要組成成分,而且是合成膽汁酸,維生素D以及甾體激素的原料。

本實驗建立了高效液相色譜法快速測定紫色疣石磺中膽甾醇含量的檢測方法。通過加標回收和精密度實驗,表明利用高效液相色譜測定紫色疣石磺中膽甾醇含量在0.102～0.510mg/mL范圍內(nèi)與峰面積值的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2為0.9998,回收率范圍在96.08%～100.98%,RSD=1.72%,膽甾醇出峰時間為13min,紫色疣石磺樣品的膽甾醇質(zhì)量濃度為503.7mg/kg。曾報道過使用蒸發(fā)光散射檢測器[23]、電化學檢測器[24]的高效液相色譜法測定膽甾醇含量的研究,本實驗使用紫外檢測器的高效液相色譜法,達到了良好的分離效果。該方法簡便、快速,準確,靈敏度和精密度高,分析時間短,能快速檢測紫色疣石磺中膽甾醇,可為石磺資源綜合利用與開發(fā)提供理論依據(jù)。

表1 回收率測定結(jié)果

表2 紫色疣石磺中膽甾醇含量

圖1 膽甾醇標準曲線

圖2 膽甾醇標準溶液色譜圖

紫色疣石磺 Peronia verruculata

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