富半胱氨酸61表達(dá)與哮喘氣道炎癥間關(guān)系的探討＊

曹 勇， 陳輝龍， 方慧娟

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸與危重病學(xué)科，武漢 430030

支氣管哮喘（以下簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是內(nèi)科的常見(jiàn)病和多發(fā)病。限于對(duì)其發(fā)病機(jī)制的有限認(rèn)識(shí)，目前仍有一部分患者的癥狀難以得到完全控制。這促使我們不斷地進(jìn)一步探討其發(fā)病機(jī)制。

研究表明，哮喘是一種由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，氣道上皮細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、Th2淋巴細(xì)胞、Th17淋巴細(xì)胞及Eotaxin、多種白細(xì)胞介素（interleukin，IL）等組成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)推動(dòng)炎癥的進(jìn)展，但是這其中有許多具體分子調(diào)控環(huán)節(jié)尚不清楚。

富半胱氨酸61（cysteine－rich 61 protein，cyr61，亦稱(chēng)CCN1），是一種富含半胱氨酸的分泌型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，屬于CNN 家族成員之一。cyr61具有促進(jìn)細(xì)胞粘附、趨化、增殖以及血管生成等功能，其可參與肌肉神經(jīng)的損傷修復(fù)過(guò)程，微血管再生，細(xì)胞免疫應(yīng)答，以及腫瘤細(xì)胞的炎癥反應(yīng)等多種疾病的病理生理過(guò)程［1－2］。近期文獻(xiàn)表明給予小鼠重組cyr61可促進(jìn)損傷氣道上皮細(xì)胞的修復(fù)［3］。但是，cyr61在哮喘中的作用尚未見(jiàn)研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)cyr61在哮喘小鼠模型肺組織中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析其與氣道炎癥間可能的聯(lián)系。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模與分組

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)全程依據(jù)《華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法條例》執(zhí)行。24只清潔級(jí)雌性BALA／c小鼠購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，鼠齡6周，體重（20±2）g。小鼠隨機(jī)分為哮喘組、地塞米松干預(yù)組、孟魯司特鈉干預(yù)組以及正常對(duì)照組，每組6只小鼠。哮喘組小鼠參考我科實(shí)驗(yàn)室既往方法［4］，即通過(guò)卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏和激發(fā)的方法制作哮喘小鼠模型。小鼠在第1天和第8天通過(guò)腹腔注射40μg OVA（購(gòu)于美國(guó)Sigma公司）和4.5mg Al（OH）3佐劑，于實(shí)驗(yàn)第22天至24天每天以2% OVA 霧化激發(fā)小鼠30min。地塞米松干預(yù)組在制作哮喘模型同時(shí)，于每次激發(fā)后腹腔注射地塞米松（1.7mg／kg）干預(yù)。孟魯司特鈉干預(yù)組在制作哮喘模型同時(shí)，于每次激發(fā)后灌胃給予孟魯司特鈉500μg（默沙東制藥，英國(guó)）干預(yù)。實(shí)驗(yàn)第25天結(jié)束，取小鼠右肺中葉做常規(guī)石蠟切片，蘇木精－伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，以觀察模型是否成功。

1.2 支氣管肺泡灌洗液的處理

通過(guò)氣管插管以1mL無(wú)菌PBS平衡液反復(fù)灌洗鼠肺3次，并回收支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。BALF 以4℃、400g離心5min。收集上清液－70℃保存以備ELISA檢測(cè)。細(xì)胞沉淀重懸后通過(guò)瑞氏－吉姆薩染色分類(lèi)計(jì)數(shù)各種炎性細(xì)胞。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)cyr61表達(dá)

山羊抗小鼠cyr61一抗購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，SP 檢測(cè)試劑盒及DAB 顯色劑購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。實(shí)驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。其中一抗cyr61工作濃度為1∶100，4℃孵育過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)中以無(wú)菌生理鹽水代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)染色呈棕黃色。采用HMIAS－2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，每張病理切片400倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值。

1.4 ELISA法檢測(cè)BALF中IL－4、IL－17A含量

IL－4和IL－17A 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)R＆D 生物公司，實(shí)驗(yàn)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所有樣品均采用雙復(fù)孔檢測(cè)，計(jì)算均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 哮喘模型的建立

哮喘組小鼠OVA 激發(fā)當(dāng)時(shí)即出現(xiàn)明顯呼吸急促，行動(dòng)遲緩。連續(xù)激發(fā)3d 后，小鼠毛色失去光澤，反應(yīng)遲鈍。病理切片觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)、小支氣管壁和伴行動(dòng)脈周?chē)休^多嗜酸性細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管皺襞增多延長(zhǎng)，杯狀細(xì)胞增生明顯，平滑肌增厚，管腔縮窄。地塞米松和孟魯司特組小鼠上述指證均較哮喘組明顯減輕（圖1）。

圖1 不同干預(yù)組小鼠肺組織HE染色圖片（×100）Fig.1 HE staining analysis of the pathological changes of mouse lung tissues in the different groups（×100）

2.2 各組小鼠BALF中炎性細(xì)胞比較

地塞米松和孟魯司特組來(lái)源的BALF 中有核細(xì)胞（nucleated cells）總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophils）以及淋巴細(xì)胞（lymphocytes）數(shù)無(wú)明顯差異，較哮喘組明顯減少（P＜0.05），但均較正常對(duì)照組明顯增多（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 不同干預(yù)組支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.2 Counts of nucleated cells，eosinophils and lymphocytes in BALF in different groups

2.3 各組小鼠BALF中IL－4和IL－17A蛋白含量比較

通過(guò)ELISA 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)地塞米松和孟魯司特組來(lái)源的BALF 中IL－4和IL－17A 水平無(wú)明顯差異，較哮喘組明顯降低（P＜0.05），但均較正常對(duì)照組明顯增高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、4。

圖3 不同干預(yù)組支氣管肺泡灌洗液中IL－4蛋白水平比較Fig.3 Comparison of the level of IL－4in BALF in different groups

圖4 不同干預(yù)組支氣管肺泡灌洗液中IL－17A 蛋白水平比較Fig.4 Comparison of the level of IL－17Ain BALF in different groups

2.4 小鼠肺組織中cyr61表達(dá)比較

通過(guò)免疫組化對(duì)cyr61進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)于小氣道上皮細(xì)胞胞質(zhì)中。在哮喘小鼠中，其表達(dá)明顯增強(qiáng)，并且氣道周?chē)?rùn)的炎癥細(xì)胞中亦有表達(dá)。通過(guò)灰度值分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)：地塞米松和孟魯司特組來(lái)源的肺組織中cyr61 表達(dá)無(wú)明顯差異，較哮喘組明顯減輕（P＜0.05），但均較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng)（P＜0.05）。見(jiàn)圖5、6。

圖5 免疫組化檢測(cè)小鼠肺組織中cyr61的表達(dá)（DAB 顯色，×200）Fig.5 Immunohistochemistry staining showing the expression of cyr61in the airways of mice in different groups（DAB，×200）

圖6 不同組別中cyr61灰度值的比較Fig.6 Comparison of the gray value of cyr61protein in different groups

2.5 小鼠肺組織中cyr61表達(dá)與氣道炎癥間關(guān)系分析

通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，cyr61與BALF中有核細(xì)胞總數(shù)（r＝0.787 4）、淋巴細(xì)胞數(shù)（r＝0.726 6）、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)（r＝0.748 2）、IL－4（r＝0.842 9）以及IL－17A 水平（r＝0.715 7）均呈正相關(guān)（均P＜0.05）。

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)傳統(tǒng)方法，即以O(shè)VA 致敏及激發(fā)小鼠的方法，制作了以嗜酸性粒細(xì)胞肺浸潤(rùn)為主的哮喘小鼠模型。在此基礎(chǔ)上，考慮到糖皮質(zhì)激素和白三烯拮抗劑目前是《全球哮喘防治倡議》所推薦的控制輕度哮喘的一線用藥，因而，被選取作為研究哮喘氣道炎癥變化的干預(yù)試劑。

通過(guò)免疫組化對(duì)cyr61蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)于小氣道上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中。在哮喘小鼠中，其表達(dá)明顯增多，并且氣道周?chē)?rùn)的炎癥細(xì)胞中亦有表達(dá)。在使用地塞米松或孟魯司特治療后，哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞中cyr61蛋白表達(dá)均明顯減少。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到cyr61在哮喘不同狀態(tài)下，氣道上皮細(xì)胞中含量有所變化，這提示cyr61可能參與了哮喘的病理生理過(guò)程。

目前研究表明：氣道上皮細(xì)胞在哮喘的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色。氣道上皮細(xì)胞作為與呼吸道局部外來(lái)抗原接觸的首道防線，對(duì)免疫反應(yīng)的激活有重要作用。它可以合成并釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，如IL－25、IL－33、IL－8、CC 型趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）－6以及CCL20等，影響炎癥細(xì)胞的趨化和功能活化［5－10］。cyr61 表達(dá)于氣道上皮細(xì)胞，因而我們進(jìn)一步分析它與有核細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及炎癥因子IL－4和IL－17的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，cyr61與BALF中有核細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。同時(shí)針對(duì)性選擇Th2細(xì)胞炎癥的代表性因子IL－4和Th17細(xì)胞炎癥的代表性因子IL－17A 進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)cyr61亦與之呈正相關(guān)。結(jié)合以上的數(shù)據(jù)和分析，cyr61可能參與了哮喘的氣道炎癥這一重要病理生理過(guò)程。

在既往的研究中，cyr61 被發(fā)現(xiàn)參與了肺損傷［11］和肺纖維化［12］的病理生理過(guò)程。cyr61 可以與多種細(xì)胞粘附分子受體如整合素α2β1，α6β1，αvβ5，αIIbβ3，αMβ2 以及αDβ2 等硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）結(jié)合發(fā)揮作用［13－15］。cyr61通過(guò)p53信號(hào)途徑活化Bax和細(xì)胞色素C誘導(dǎo)纖維細(xì)胞凋亡。cyr61還可通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）和核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB 等信號(hào)途徑影響細(xì)胞合成和分泌。在本實(shí)驗(yàn)中，哮喘小鼠氣道上皮中cyr61異常增高，分析原因，有可能是通過(guò)粘附分子，或是通過(guò)影響ERK 或NF－κB，或是通過(guò)影響凋亡，或是通過(guò)其他途徑影響氣道炎癥。其中的具體環(huán)節(jié)及可能的機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

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