菊三七根中化合物seneciphyllic acid和senecinic acid的含量測定

劉 芳 郭志勇 程 凡 周海峰 鄒 坤 鄧張雙

（三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443002）

菊三七（Gynura japonica）為菊科（compositae）菊三七屬植物，湖北地區(qū)的利川、當(dāng)陽以及神農(nóng)架，全國大部分地區(qū)均有分布［1］.菊三七亦為長江三峽庫區(qū)民間廣為使用的民間中草藥［2］，民間用于跌打損傷［3］、創(chuàng)傷出血［4］、鎮(zhèn)痛6［5］、抗炎［6］等.本文對自菊三七乙酸乙酯部位中分離得到的化合物seneciphyllic acid和senecinic acid，采用制備HPLC 技術(shù)進(jìn)行純化，以純化后的化合物為標(biāo)準(zhǔn)品，采用分析型高效液相色譜法測定菊三七根部seneciphyllic acid和senecinic acid的含量，為更好地利用傳統(tǒng)中草藥菊三七提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與儀器

1.1 試藥

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱取seneciphyllic acid標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇配置成質(zhì)量濃度為0.10、0.20、0.40、0.60、0.80mg·mL－1的系列對照品溶液.精密稱取senecinic acid標(biāo)準(zhǔn)品適量，加甲醇配置成質(zhì)量濃度為0.10、0.30、0.50、1.00、1.50mg·mL－1的系列對照品溶液.用0.45μm 的有機(jī)濾膜過濾，備用.

1.2 儀器與設(shè)備

DIONEX Ultimate 3000型高效液相色譜儀（美國戴安液相色譜有限公司）；N1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；ME215S型十萬分之一電子天平（德國Sartorius）.

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Acclaim C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇／甲酸溶液；洗脫梯度：甲醇∶0.1%甲酸溶液＝38∶62（v·v－1）；流速：1.0mL·min－1；檢測波長：220nm；柱溫：30℃；檢測時(shí)間：20 min.分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣，依上述色譜條件測定.依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品在色譜圖上的保留時(shí)間，在供試品溶液的色譜圖中找出相對應(yīng)的色譜峰.其中：seneciphyllic acid的色譜保留時(shí)間為12.78min；senecinic acid 的色譜保留時(shí)間為16.32min，達(dá)到基線分離.

2.2 樣品預(yù)處理

精密稱取干燥的菊三七根粉末1.2g，加入25mL乙醇70℃回流提取3次，過濾，濾液減壓濃縮至干，得到100mg浸膏，用5mL 色譜甲醇溶解，定容，用0.45μm 的有機(jī)濾膜過濾，備用.

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品seneciphyllic acid溶液10 μL進(jìn)樣，按2.1中色譜條件測定色譜峰面積，以峰面積Y 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X（mg·mL－1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸.結(jié)果表明，在對照品質(zhì)量濃度為0.10～0.80mg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程：Y＝85.518X＋0.954 2，r＝0.999 7.

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品senecinic acid溶液10μL進(jìn)樣，按2.1中色譜條件測定色譜峰面積，以峰面積Y 為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度X（mg·mL－1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸.結(jié)果表明，在對照品質(zhì)量濃度為0.10～1.50mg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程：Y＝143.19 X＋9.195 9，r＝0.999 8.

3.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品seneciphyllic acid 溶液0.20、0.40、0.80mg·mL－1各10μL，按2.1中色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，測定色譜峰面積，計(jì)算其RSD 分別為1.50%.

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品senecinic acid溶液0.30、0.50、1.00mg·mL－1各10μL，按2.1中色譜條件連續(xù)進(jìn)樣，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，測定色譜峰面積，計(jì)算其RSD 分別為1.1%.

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取一定質(zhì)量濃度的seneciphyllic acid和senecinic acid溶液10μL，于0、2、4、6、8、10、12、24h分別進(jìn)樣分析，測定其峰面積，其RSD 值為1.40%和1.70%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取干燥的菊三七根粉末1.2g，6份.按2.2方法平行制備，在2.1色譜條件下進(jìn)行分析，測定seneciphyllic acid為2.961 3mg·g－1，0.296 1%，RSD值為1.30%；測定senecinic acid為0.954 2mg·g－1，0.095 4%，RSD值為1.20%，表明該方法重復(fù)性良好.

3.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的菊三七乙醇浸膏5份，每份約100mg，各樣品分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)品seneciphyllic acid和標(biāo)準(zhǔn)品senecinic acid適量，按樣品溶液制備方法平行制備.

在2.1色譜條件下，分別進(jìn)樣10μL 進(jìn)行測定，得平均回收率及其RSD 值，結(jié)果見表1.

表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié) 論

本文利用正相硅膠層析、制備高效液相色譜等技術(shù)，從菊三七乙酸乙酯部位分離純化得到主要化學(xué)成分seneciphyllic acid和senecinic acid.以seneciphyllic acid和senecinic acid為標(biāo)準(zhǔn)品，采用回流提取輔助浸提的方法制備菊三七測試樣，建立了HPLC 法測定菊三七根部seneciphyllic acid 和senecinic acid含量的方法體系.測得菊三七根部seneciphyllic acid和senecinic acid 的含量分別為2.961 3mg·g－1、0.954 2mg·g－1，RSD 分別為1.34%、1.28%.同時(shí)還進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明方法的精密度、穩(wěn)定性、回收率等指標(biāo)均滿足測定要求，可為菊三七藥材的質(zhì)量控制提供參考，為開發(fā)利用民間中草藥菊三七提供理論研究基礎(chǔ).

［1］ 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志第七十七卷第一分冊［M］.北京：科學(xué)出版社，1999：312－313.

［2］ 余甘霖，沈 力，易東陽，等.長江三峽庫區(qū)中草藥資源調(diào)查研究［J］.實(shí)用中醫(yī)藥雜志，2005，21（3）：187.

［3］ 曾曉瓊，宋一心.菊三七對運(yùn)動性骨折治療作用的研究［J］.西安體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2003（3）：64－65.

［4］ 劉賀之，龐 健，王增嶺，等.菊三七與參三七對血小板超微結(jié)構(gòu)影響的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1982，17（11）：23－24.

［5］ 張銘龍，劉文彬，李星元，等.菊三七生物堿的提取以及類似物的藥理活性比較［J］.吉林中醫(yī)藥，1998（4）：35－38.

［6］ 林 菁，林建忠，李常春，等.紅番莧水提物的抗炎作用［J］.福建中醫(yī)藥，1996，27（2）：23－24.