壁虎醇提物誘導(dǎo)人喉癌細(xì)胞Hep2 凋亡的實驗研究

崔朝初，王建剛* ，段冷昕，錢 昕，王彩娥，徐新麗

1河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)與醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實驗室;2 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，洛陽471003

中國傳統(tǒng)中藥材壁虎(天龍)具有抑菌、抗腫瘤、抗驚厥及溶血的功效。大量的基礎(chǔ)實驗和臨床研究證實，在多種惡性腫瘤中壁虎可通過升高bax等基因的表達(dá)誘導(dǎo)凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用［1］。本課題組前期研究成果也顯示壁虎干粉能抑制腫瘤細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡［2，3］。有文獻(xiàn)報道壁虎可以用于治療晚期喉癌［4］，但機(jī)制尚未明確。本文通過對壁虎干粉進(jìn)一步提取分離，得到壁虎乙醇提取物(GEE)并對其在喉癌細(xì)胞Hep2 中誘導(dǎo)凋亡的作用進(jìn)行了研究。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

壁虎(Gekko japonicus ，光明飲片加工廠有限公司);胰酶(Sigma 公司);RPMI-1640 干粉(Gibco 公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma 公司);Hoechst 33258(Sigma 公司);一抗β-actin，一抗caspase-3，一抗VEGF，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(Santa Cruz 公司);阿霉素(ADR，浙江海正藥業(yè)有限公司);PVDF膜(PALL 公司)。

1.2 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(Sanyo 公司);超凈工作臺SP2DJ22B 型(金壇市榮華儀器制造有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司);ELx800 酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司);膠體磨(上海諾尼輕工機(jī)械有限公司);冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);熒光顯微鏡(Olympus 公司);96 孔、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar 公司)，Mini trans-blot 電轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad 公司)。

1.3 細(xì)胞株

人喉癌Hep2 細(xì)胞株由中國藥科大學(xué)惠贈，用含10%胎牛血清的1640 完全培養(yǎng)液于37 ℃恒溫，5% CO2，95%飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2 實驗方法

2.1 GEE 的制備

取100 g 干壁虎粉與400 mL 雙蒸水混勻置于膠體磨中勻漿，然后4 ℃離心取沉淀。將所得沉淀溶于400 mL 一定濃度的乙醇溶液中后置于4 ℃冰箱。每0.5 h 攪勻一次，4 h 后離心取上清。減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，冷凍干燥得到7.2 g 金黃色固體，稱之為壁虎乙醇提取物(GEE)，貯存于-20 ℃冰箱備用。

2.2 MTT 法測定細(xì)胞活性

分別將GEE 干粉溶于含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液，使GEE 濃度分別為125、150、200、250、300、400、500 μg/mL 備用。將處于對數(shù)生長期的Hep2 細(xì)胞以每孔1 ×104個接種于96 孔板，每孔200 μL。過夜培養(yǎng)后棄上清，將配置好的不同濃度(125、150、200、250、300、400、500 μg/mL)的GEE 溶液分別加入培養(yǎng)板并設(shè)置空白對照組(只加含10%胎牛血清的1640 完全培養(yǎng)液)，每孔200 μL，分別培養(yǎng)24、48、72 h。結(jié)束前4 h 每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，每孔加二甲基亞砜(DMSO)200 μL，避光輕微振蕩10 min。于酶標(biāo)儀490 nm 波長處測定各孔的吸光度A，并按下式計算抑制率:抑制率(%)=［1-(A實驗組/A陰性對照)］×100%，實驗重復(fù)3 次。

2.3 Hoechst 33258 熒光染色法觀察Hep2 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變

將處于對數(shù)生長期的Hep2 細(xì)胞以2 ×105/孔接種于鋪有蓋玻片的6 孔板中，用不同濃度(100、200、250 μg/mL)的GEE 及0.5 μg/mL ADR 分別處理48 h，并設(shè)置陰性對照組(CONTROL)。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，細(xì)胞爬片用PBS 洗滌三次，于10 μg/mL的Hoechst 33258 染色液中避光孵育10 min，取出細(xì)胞爬片用PBS 洗滌3 次，于熒光顯微鏡下觀察。

2.4 Western blot 法檢測caspase-3、VEGF 蛋白的表達(dá)

將處于對數(shù)生長期的Hep2 細(xì)胞以2 ×105/孔接種于6 孔板，分別用ADR(0.5 μg/mL)和不同劑量的GEE(100、200、300 μg/mL)處理并設(shè)置陰性對照組(CONTROL)。培養(yǎng)48 h 后，棄上清，每孔分別加入100 μL 蛋白裂解液裂解，在冰浴下靜置裂解10 min，收集蛋白并定量。95 ℃加熱5 min 后，每組分別取等量蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠，于4 ℃下250 mA 電流轉(zhuǎn)印150 min 至PVDF 膜，脫脂奶粉封閉1 h 后，分別加入一抗β-actin、caspase-3、VEGF 于37 ℃孵育1 h，加二抗，于37 ℃孵育1 h，DAB 顯色。

2.5 統(tǒng)計分析

3 實驗結(jié)果

3.1 GEE 對Hep2 增殖的抑制作用

MTT 結(jié)果(圖1)顯示125、150、200、250、300、400、500 μg/mL 的GEE 在不同程度上均能抑制Hep2 細(xì)胞的增殖，其抑制作用隨濃度增加、時間的延長而加強(qiáng)，呈劑量和時間依賴性。GEE 作用24、48、72 h 后 其IC50值分 別為336. 858、237. 949、188.991 μg/mL。

圖1 GEE 對Hep2 細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 The anti-proliferative effect of GEE on Hep2 cells

3.2 Hep2 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變

Hoechst 33258 熒光染色后，由圖2 可知，未經(jīng)藥物處理的CONTROL 組(A 組)，細(xì)胞呈彌漫性均勻熒光，且熒光較弱。在各用藥組中，Hep2 細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生明顯改變，核固縮呈致密的顆粒狀強(qiáng)熒光，尤其是GEE 高劑量組(E 組)出現(xiàn)凋亡的典型形態(tài)學(xué)變化，可見清晰的凋亡小體。

圖2 GEE 誘導(dǎo)Hep2 細(xì)胞發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變Fig.2 The morphological changes of Hep2 cells treated with GEE

3.3 GEE 對Hep2 中caspase-3、VEGF 蛋白表達(dá)的影響

如圖3 所示，隨著GEE 濃度的增加，caspase-3蛋白的表達(dá)明顯升高，VEGF 蛋白表達(dá)明顯降低，表現(xiàn)為劑量依賴性。ADR、GEEH、GEEM、GEEL 各組與control 相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

圖3 GEE 對Hep2 細(xì)胞中caspase-3、VEGF 蛋白含量表達(dá)的影響Fig.3 The protein expression of caspase-3，VEGF in Hep2 cells treated with GEE

4 討論

目前對于腫瘤的治療，臨床上主要采用以化療為主的綜合性治療。常規(guī)化療藥有嚴(yán)重的毒副反應(yīng)及耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，使其應(yīng)用和療效受到了限制，因此開發(fā)無毒副作用的天然藥物治療腫瘤已成為眾多研究者的焦點(diǎn)［5］。傳統(tǒng)中藥壁虎的抗腫瘤作用已經(jīng)得到證實，但研究的并不深入，其有效成分和作用機(jī)制尚未闡明，在Hep2 細(xì)胞中的抗腫瘤作用研究較少。本文研究了GEE 組分在人喉癌hep2 細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的作用。結(jié)果顯示GEE 對Hep2 細(xì)胞增殖有抑制作用且能使其發(fā)生典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化。125～500 μg/mL 的GEE 在作用24、48、72 h 后IC50值分別為336.858、237.949、188.991 μg/mL。

細(xì)胞增殖過度和細(xì)胞凋亡異常是腫瘤發(fā)生的生物學(xué)基礎(chǔ)。因此，如何調(diào)控凋亡相關(guān)基因或其產(chǎn)物，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡是腫瘤治療取得成功的關(guān)鍵［6］。Caspase-3 是細(xì)胞凋亡過程中的主要效應(yīng)因子，大多數(shù)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素，最終均需要通過激活caspase-3，進(jìn)而通過裂解包括procaspase 2、6、7、9，以及Bcl-2、PARP (poly ADP-ribose polymerase)，ICAD (inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)，gelsolin 和fodrin 等組分誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7］。有研究證實，caspase-3 基因的突變和缺失可增加腫瘤發(fā)生的幾率［8］。本研究結(jié)果顯示，隨著GEE 劑量的增加，caspase-3 蛋白表達(dá)逐漸增多，提示GEE 可劑量依賴性調(diào)控caspase-3 蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)Hep2 細(xì)胞的凋亡。

VEGF 是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長的特異性有絲分裂原，可增加轉(zhuǎn)錄潛能，還具有增加血管通透性的效應(yīng)。VEGF 與其受體結(jié)合后可釋放多種因子，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，從而為腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。此外，抑制VEGF 蛋白的表達(dá)還可引起線粒體色素C 的釋放及caspase-3 蛋白表達(dá)的增加，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生［9］。目前，在眾多惡性腫瘤中VEGF 已成為重要的治療靶點(diǎn)［10］。本研究結(jié)果表明，隨著GEE 劑量的增大，VEGF 蛋白表達(dá)減少。

綜上所述，GEE 組分可能通過上調(diào)caspase-3 和抑制VEGF 蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)Hep2 細(xì)胞的凋亡。但GEE 成分復(fù)雜，究竟是何種物質(zhì)發(fā)揮作用及其機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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