3 種根皮素酰腙衍生物的合成及抑制酪氨酸酶和抗氧化活性

杜 鵬，余燕影* ，曹樹(shù)穩(wěn)，2

1南昌大學(xué)化學(xué)系，南昌330031;2 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌大學(xué)，南昌330047

酪氨酸酶(EC.1.14.18.1)廣泛存在于動(dòng)植物體，在動(dòng)植物體內(nèi)酶促褐變、體內(nèi)色素合成的過(guò)程中起了關(guān)鍵的作用。它具有單酚酶的活性能將酪氨酸羥化，產(chǎn)生鄰位二羥基苯丙氨酸(L-多巴)，也具有二酚酶的活性，能將L-多巴氧化成多巴醌，進(jìn)而生成黑色素［1］。酪氨酸酶抑制劑就是通過(guò)抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)酪氨酸酶抑制劑的研究非?；钴S。根皮素(Phloretin)為具有二氫查爾酮類結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，是近年來(lái)國(guó)外研究較多的一種具有生物活性的天然化合物，主要分布于蘋(píng)果、梨等多汁水果的果皮及根皮。具有抗氧化［2］，抗突變，抗炎及抗腫瘤等生理功效，同時(shí)又有美白，抗皺等美容功效，能抑制酪氨酸酶和黑色素細(xì)胞活性［3］，對(duì)各種皮膚色斑有淡化作用，是一種較有開(kāi)發(fā)前景的新型皮膚美白劑，因此它在美容行業(yè)也受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾的報(bào)道并不多見(jiàn)。

酰腙類化合物屬于席夫堿的一種，不僅具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且在抗菌，抗炎、抗病毒及抗腫瘤等方面有著獨(dú)特的生物和藥理活性。本文以根皮素為母體，與三種酰肼化合物結(jié)合，引入活性基團(tuán)，合成了三種新型的酰腙類化合物，提高根皮素的生物活性，以期獲得高效、安全的酪氨酸酶抑制劑，開(kāi)拓其應(yīng)用領(lǐng)域。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

UV-2450 紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);FTIR Nicolet5700 傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)熱電尼高力公司);AV-600 型核磁共振儀(德國(guó)BRUKER 公司);ZQ4000/2695 型液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Waters 公司);X-4 顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(溫度計(jì)未校正);DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器;DZF-150數(shù)顯小型恒溫真空干燥箱;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

根皮素(98%，陜西華泰精細(xì)化工);苯甲酰肼(99%)、水合肼(85%)、水楊酸甲酯(98%)、對(duì)羥基苯甲酸乙酯(99%)、對(duì)甲苯磺酸(99%)均購(gòu)買(mǎi)于國(guó)藥化學(xué)試劑廠;酪氨酸酶(1881 U/mg，Sigma 公司);DPPH(Sigma 公司);硅膠(200～300 目，青島海浪硅膠干燥劑廠);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，所用水均為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 根皮素酰腙衍生物1～3 的合成

2-羥基苯甲酰肼和4-羥基苯甲酰肼的合成分別按照文獻(xiàn)［4，5］的方法合成。2-羥基苯甲酰肼的合成方法為:將7.60 g 水楊酸甲酯(0.05 mol)和20 mL 85%水合肼溶入無(wú)水乙醇中，80.0 ℃加熱回流10 h，蒸出大部分乙醇，冷卻、攪拌，有白色沉淀生成，抽濾。乙醇重結(jié)晶，抽濾、干燥得白色針狀晶體。產(chǎn)率95%，熔點(diǎn)m.p.148.0～149.0 ℃;4-羥基苯甲酰肼的合成方法如下:稱取9. 97 g 4-羥基苯甲酸乙酯(0.06 mol)，加入25 mL 85%水合肼，80.0 ℃加熱回流15 min，再加入20 mL 乙醇，繼續(xù)加熱回流4 h，蒸出部分乙醇，冷卻，抽濾得白色沉淀。乙醇重結(jié)晶，抽濾、干燥得到白色粉末。產(chǎn)率為90%，熔點(diǎn)m.p.258.0～260.0 ℃。

化合物1～3 的合成方法參考文獻(xiàn)［6］。分別稱取15 mmol 根皮素(4.1139 g)及15 mmol 酰肼置于250 mL 三頸瓶中，加入70 mL 無(wú)水乙醇攪拌溶解后，加入30 mL 甲苯和0.3 g 對(duì)甲苯磺酸，在88.0℃回流分水反應(yīng)48 h。用200～300 目硅膠柱層析，TLC 跟蹤檢測(cè)，所用洗脫劑分別為:乙酸乙酯/石油醚=2∶1(化合物1);氯仿/甲醇=8∶1(化合物2);乙酸乙酯/石油醚=1∶1(化合物3)。將洗脫液收集、濃縮、真空干燥至恒重，分別得到目標(biāo)產(chǎn)物。

圖1 根皮素酰腙衍生物1～3 的合成路線Fig.1 Synthesis routes for compounds 1-3

1.2.2 抑制酪氨酸酶活性研究

酪氨酸酶活力的測(cè)定是基于L-DOPA 的酶催化氧化產(chǎn)物—多巴色素在475 nm 處有最大吸收，吸光系數(shù)ε=3700 (cm· mol/ L)-1。酪氨酸酶活力單位(U/ min)規(guī)定:以每分鐘多巴色素在475 nm 處的吸光度(A475)增加0.001 為一個(gè)酶活力單位。所以，通過(guò)測(cè)定酶催化反應(yīng)體系的A475隨時(shí)間的增長(zhǎng)直線，從直線斜率即可求得酶活力。

參照文獻(xiàn)［7］的方法略作修改:在3 mL 的反應(yīng)體系中，將0.3 mL 的5.0 mmol/L L-DOPA 溶液(溶劑為pH =6. 8 的磷酸鹽緩沖液)加入0. 6 mL 的0.25 mol/L 的PBS 緩沖溶液和1.9 mL 的蒸餾水，在30 ℃恒溫水浴中恒溫10 min，加入0.1 mL 的不同濃度樣品溶液(DMSO 溶劑)和0.1 mL 酪氨酸酶水溶液(160 μg)，測(cè)定OD475。此測(cè)活體系中酶的終質(zhì)量濃度為5.3 μg/mL。

待測(cè)樣品對(duì)酪氨酸酶的抑制率按下式計(jì)算:

抑制率( %) =(1 -OD1/OD2) ×100%

式中:OD1是指含有底物、酪氨酸酶、待測(cè)樣品的測(cè)活體系的酶活力值;OD2是指含有底物、酪氨酸酶，但不含樣品的測(cè)活體系的酶活力值。

1.2.3 清除DPPH 自由基研究

參照Lee YL 等［8］方法略作修改:比色管中依次加入不同濃度受試樣品1 mL 及0.6 mmol/L DPPH甲醇溶液0.5 mL，然后以甲醇補(bǔ)充體積至5 mL，30 min 室溫避光反應(yīng)后于517 nm 處測(cè)定吸光值。平行測(cè)定三次，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

其中:A1為不加樣品，加入DPPH 時(shí)的吸光度值;A2為加入樣品和DPPH 時(shí)的吸光度值。

1.2.4 總抗氧化能力( ABTS 自由基)

參照Re，R［9］的方法略作修改。ABTS 自由基的生成方法:將7 mmol/L 的ABTS 水溶液與2.45 mmol/L 的K2S2O8溶液混合，在室溫暗處放置12～16 h 后使用。使用前將ABTS 自由基儲(chǔ)備液用乙醇稀釋至吸光度值為0.70 ±0.02(734 nm 處)。比色管中依次加入系列濃度的受試樣品0.5 mL 以及ABTS·+工作液5 mL，以乙醇溶液作為空白對(duì)照，室溫避光反應(yīng)6 min 后于734 nm 處測(cè)定吸光值。平行測(cè)定三次，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

其中，A1為不加樣品，加入ABTS·+時(shí)的吸光度值;A2為加入樣品和ABTS·+時(shí)的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 UV 光譜

將根皮素及其酰腙分別溶于無(wú)水乙醇，配成濃度為1 ×10-5mol/L 的溶液，測(cè)定紫外-可見(jiàn)吸收光譜，測(cè)定波長(zhǎng)為200～600 nm，結(jié)果見(jiàn)圖2:

圖2 化合物的紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig.2 UV-Vis spectra of phloretin and its hydrazone 1-3

由圖可知，根皮素在225、286 nm 處有兩個(gè)強(qiáng)吸收峰，酰腙與母體相比，峰Ⅰ由286 nm 紅移至310 nm(1)、312.5 nm(2)、314 nm(3)，強(qiáng)度略增。是由于形成酰腙后，次氨基氮原子的孤對(duì)電子與羰基和亞氨基雙鍵形成了p-π 共軛體系，使得根皮素母體的共軛體系延長(zhǎng)，導(dǎo)致吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。

2.1.2 IR 光譜

用KBr 壓片，測(cè)定根皮素及其酰腙衍生物1～3的紅外特征吸收峰，測(cè)量范圍400～4000 cm-1，數(shù)據(jù)見(jiàn)表1:

表1 化合物的主要紅外吸收頻率及歸屬(cm-1)Table 1 IR spectra data of phloretin and its hydrazone 1-3

根皮素的羰基振動(dòng)頻率ν (C =O)在1633 cm-1處出現(xiàn)較弱特征吸收峰，形成酰腙后，化合物1～3分別在1631、1627、1638 cm-1處出現(xiàn)C=N 很強(qiáng)的特征吸收峰，3296、3254、3363 cm-1處出現(xiàn)了NH 伸縮振動(dòng)特征峰，分別在1592、1587、1609 cm-1處出現(xiàn)NNH 彎曲振動(dòng)特征峰，這均說(shuō)明合成了酰腙。

2.1.31H NMR 及13C NMR 譜學(xué)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)

Phloretin benzoyl hydrazone(化合物1)Yield:39%;mp. :258～260 ℃;1H NMR (DMSO-d6，600 MHz)δ:2.76(2H，t，J =7.8 Hz，β-H)，3.19(2H，t，J =7.8 Hz，α-H)，5.76 (2H，s，3'，5'-H)，6.66 (2H，dd，J =2.4，2.4 Hz，3，5-H)，7.01(2H，m，2，6-H)，7.53(2H，dd，J =7.2，1.2 Hz，3''，5''-H)，7.60(1H，d，J=0.6 Hz，4''-OH)，7.92(2H，dd，J=1.2，0.6 Hz，2''，6''-H)，8.73 (1H，d，J =2.4 Hz，N-NH)，9.13 (1H，s，4-OH)，10.45(1H，d，J =0.6Hz，4'-OH)，12.24(2H，s，2'，6'-OH);13C NMR(DMSO-d6，150 MHz)δ:203.6 (-C=O)，166.7 (-C=N)，166.3 (C-2')，164.4 (C-6')，156.5 (C-4')，155.8 (C-4)，133.0 (C-1)，132.4 (C-2'')，132.2(C-6'')，129.6 (C-1'')，129.0 (C-3'')，129.0 (C-5'')，127.9 (C-4'')，127.8 (C-1')，115.5 (C-2，6)，103.2 (C-3，5)，90.4(C-3'，5')，45.7 (C-β)，30.1(C-α);ESI-MS:m/z calcd for C22H20O5N2［M +Na+］415.39，found［M+Na+］415.06。

Phloretin 2-hydroxy benzoyl hydrazone(化合物2) Yield:41%;mp. :254～256 ℃;1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:2.76 (2H，t，J=7.8 Hz，β-H)，3.19 (2H，t，J=7.8 Hz，α-H)，5.77 (2H，s，3'，5'-H)，6.65 (2H，dd，J=1.8，2.4 Hz，3，5-H)，6.96(2H，m，3''，6''-H)，7.01 (2H，t，J =2.4 Hz，2，6-H)，7.45 (1H，t，J = 6.6，1.8 Hz，5''-H)，7.88(1H，m，J =1.8，1.2 Hz，4''-H)，8.78 (1H，s，NNH)，9.12 (1 H，s，4-OH)，10.52 (1H，s，4'-OH)，11.84 (1H，s，2''-H)，12.24 (2H，s，2'，6'-OH);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:203.7 (-C = O)，169.0 (-C = N)，164.4 (C-2'')，159.7 (C-2'，6')，156.1 (C-4'')，155.8 (C-4)，134.6 (C-1)，132.2(C-1'')，129.6 (C-4'')，128.6 (C-6'')，119.5 (C-5'')，117.8 (C-3'')，115.5 (C-1')，115.3 (C-2，6)，103.3 (C-3，5)，90.5 (C-3'，5')，45.8 (C-β)，30.1(C-α);ESI-MS:m/z calcd for C22H20O6N2［M-H+］407.40，found［M-H+］406.89。Phloretin 4-hydroxy benzoyl hydrazone(化合物3) Yield:45%;mp. :277～279 ℃;1H NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:2.75 (2H，t，J =7.8Hz，β-H)，3.17 (2H，t，J=7.8 Hz，α-H)，5.73 (2H，s，3'，5'-H)，6.65 (2H，d，J=2.4 Hz，3，5-H)，6.65 (2H，d，J=8.4 Hz，3''，5''-H)，7.01 (2H，d，J=8.4 Hz，2，6-H)，7.79 (2H，t，J =9.0 Hz，2''，6''-H)，8.65(1H，s，N-NH)，9.14 (1H，s，4-OH)，10.13 (1H，s，4'-OH)，10.20 (1H，s，4''-OH)，12.24(2H，s，2'，6'-OH);13C NMR (DMSO-d6，150 MHz)δ:203.5 (-C=O)，166.3 (-C=N)，164.2 (C-4'')，161.2 (C-2'，6')，156.7 (C-4')，155.8 (C-4)，132.2 (C-1，1')，129.8 (C-1')，129.5 (C-2'，6')，123.6 (C-3''，5'')，115.5 (C-2，6)，103.2 (C-3，5)，90.4 (C-3'，5')，45.6 (C-β)，30.1(C-α);ESI-MS:m/z calcd for C22H20O6N2［M-H+］407.40，found［M-H+］406.51。

2.2 活性研究

2.2.1 化合物對(duì)酪氨酸酶活力的影響

圖3 抑制酪氨酸酶活力IC50Fig.3 Inhibitory IC50 for Phloretin，hydrazone 1-3 against tyrosinase

由圖3 可知，化合物抑制酪氨酸酶活力大小的順序是:化合物2 ＞曲酸＞化合物3 ＞化合物1 ＞根皮素。與根皮素相比較，根皮素苯甲酰基腙(1)雖表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制能力，但兩者之間沒(méi)有顯著性差異(P ＞0.05);根皮素2-羥基苯甲酰基腙(2)和根皮素4-羥基苯甲?；?3)的抑制酶活力能力得到明顯提高，呈現(xiàn)顯著性差異(P ＜0.05)，且酰腙2(芳?；江h(huán)鄰位有一個(gè)羥基)的抑制能力比酰腙3(芳?；江h(huán)對(duì)位有一個(gè)羥基)強(qiáng)，甚至強(qiáng)于常用美白劑曲酸，這可能是因?yàn)轷；江h(huán)上羥基的位置不同所產(chǎn)生的影響［10］。

2.2.2 清除DPPH 自由基

圖4 清除DPPH 自由基能力Fig.4 Scavenging activity of samples on DPPH radicals

由圖4 可知，化合物清除DPPH 自由基的能力順序是:2 ＞3 ＞1 ＞BHA ＞BHT ＞根皮素。新合成的三種化合物的清除DPPH 自由基的能力相比根皮素都有了顯著提高，并且強(qiáng)于常用抗氧化劑BHA 和BHT。酰腙2 和3 的IC50明顯小于酰腙1 和根皮素，說(shuō)明在芳?；胍粋€(gè)羥基后的酰腙化合物具有更好的自由基清除能力。酰腙2 清除自由基能力強(qiáng)于3，這也證明芳?；江h(huán)上羥基的個(gè)數(shù)和位置在化合物清除DPPH 自由基能力中有著關(guān)鍵作用。

2.2.3 總抗氧化能力

圖5 清除ABTS 自由基能力Fig.5 Scavenging activity of samples on ABTS radicals

由圖5 中的IC50值可知，各受試樣品均具有較強(qiáng)的清除ABTS 自由基能力，根皮素和酰腙1～3 的清除ABTS 自由基的能力都強(qiáng)于常用抗氧化劑BHA和BHT，酰腙2 和3 的清除能力顯著高于母體根皮素和1，而根皮素和酰腙1 的清除能力相當(dāng)(P ＞0.05)，酰腙2 (IC50= 1.60 ± 0.053 μM)的清除ABTS 自由基能力最強(qiáng)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明芳酰基苯環(huán)上羥基的個(gè)數(shù)和位置在化合物清除ABTS 自由基能力中發(fā)揮著重要作用。

3 結(jié)論

以天然活性物質(zhì)作為先導(dǎo)化合物，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造，是天然產(chǎn)物研究熱點(diǎn)之一。本文中以根皮素為母體合成了三種酰腙類化合物，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。抑制酪氨酸酶活性和清除自由基實(shí)驗(yàn)表明，酰腙2 和3 的抑制酪氨酸酶能力相比母體根皮素有了明顯提高;酰腙1～3 清除DPPH 自由基的能力得到明顯提高且均大于陽(yáng)性對(duì)照品BHA、BHT;新合成酰腙2 和3 清除ABTS 自由基的能力也有了明顯增強(qiáng)。對(duì)物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系探討表明，化合物芳?；江h(huán)上羥基的個(gè)數(shù)和位置在抑制酪氨酸酶和清除自由基能力中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

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